qnr介导细菌对喹诺酮类耐药机制的研究

【摘要】： 全球范围内革兰阴性菌对氟喹诺酮类抗菌药耐药性的上升引起了医学界的重视。传统的理解认为细菌对喹诺酮类的耐药是由于突变所致,耐药性为垂直传递。这难以解释为何原本非常敏感的微生物迅速产生了耐药,且细菌常同时对喹诺酮类及其他类别抗菌药耐药。最近发现的质粒介导喹诺酮类耐药机制可部分解释耐药率上升迅速的原因。 目前发现的质粒介导耐药机制有三种：1.五肽重复序列蛋白Qnr：保护DNA旋转酶免受喹诺酮类药物的抑制,此类蛋白很可能来源于水生细菌。2.AAC(6')-Ib-cr:一种氨基糖肽类乙酰转移酶,可以修饰环丙沙星及诺氟沙星而使其抗菌活性下降。这是首次发现自然界存在的酶修饰完全人工合成药物。3.外排泵QepA和OqxaAB。这三种机制都可以导致细菌对喹诺酮类药物敏感性下降,进而促进细菌产生更高水平的耐药。 本研究对qnr新基因、qnr基因的表达调控及其在霍乱弧菌对喹诺酮类耐药性形成中的作用进行了研究,发现了一个新的qnr基因(qnrC),发现qnrB受SOS的调控,明确了qnrVC3与染色体的靶位突变共同促进了霍乱弧菌对喹诺酮类耐药性的上升,本研究有助于我们进一步了解细菌对喹诺酮类耐药性的形成机制,指导临床合理应用喹诺酮类药物。 研究背景：自1998年发现第一个质粒介导喹诺酮类耐药基因-qnrA以来,国际上又陆续报道了另外两个qnr基因-qnrB和qnrS。这三个耐药基因在世界范围内临床分离菌中广泛分布,但不同基因间的同源性低,我们推测临床株中尚存在未被发现的新的qnr基因。在此部分研究中,我们在肠杆菌科细菌临床株中进行新的喹诺酮类耐药基因筛选,以期发现新的耐药基因。 材料与方法：收集复旦大学附属华山医院2005-2007年临床分离的肠杆菌科细菌。通过临床菌株与耐叠氮钠的大肠埃希菌J53接合试验,筛选对环丙沙星敏感性下降的接合子。提取接合子的质粒,并对质粒进行酶切克隆分析和测序,确定引起敏感性下降的基因。通过PCR方法检测新qnr基因在临床分离菌中的流行情况。 结果：在尿路感染患者的尿标本中分离到的一株奇异变形杆菌对氨苄西林、磺胺甲基异噁唑、甲氧苄啶耐药外对大多数抗菌药物敏感。这株细菌中含有的质粒pHS10,可以通过接合转移至大肠埃希菌J53。含有pHSl0的大肠埃希菌J53对环丙沙星敏感性下降,但是通过PCR检测并未发现已知的qnr基因、aac(6')-Ib-cr和qepA。奇异变形杆菌临床株和含pHS10 J53接合子的环丙沙星最低抑菌浓度(MIC)均为0.25μg／ml,较受体菌J53有32倍的上升。为进一步确定引起喹诺酮类敏感性下降的基因,对pHS10通过多种限制性内切酶消化后与质粒载体pUC18连接,连接后的产物转化至大肠埃希菌TOP10,通过氨苄西林和环丙沙星选择转化子。通过对转化子质粒的测序分析,发现了由HindⅢ酶切后的一个4.4kb的DNA片段可以介导喹诺酮类耐药。测序分析和进一步的克隆证明引起耐药的是其中一个含有666碱基对的基因,按照国际认可的命名原则,命名为qnrC。该基因编码221氨基酸的五肽重复序列蛋白QnrC。QnrC与QnrA1、QnrB1、QnrS1、QnrD相比,氨基酸同源性分别为64%、42%、59%、43%。QnrC基因的上游存在一个新的IS3家族的插入序列(insertion sequence, IS),命名为ISPmill,编码含有读码框移动的转座酶,推测这一结构与qnrC的摄入与传播有关。以PCR方法对2020株临床分离的肠杆菌科细菌进行检测,未发现qnrC基因。 结论：在这部分研究中,在奇异变形杆菌中发现了新的质粒介导喹诺酮类耐药基因qnrC。 研究背景：通过DNA结构分析发现,在qnrB基因的上游含有一个LexA结合位点。而这一位点在qnrA或qnrS周边则不存在。LexA蛋白是细菌SOS调控系统中的重要组成部分。在大肠埃希菌中,RecA刺激LexA的分解,可诱导40多种基因表达的SOS调控系统。细菌籍SOS调控系统对DNA损伤做出反应。已知喹诺酮类药物和丝裂霉素等可以损伤细菌DNA,诱导SOS反应。该部分研究旨在了解qnrB的表达是否受SOS系统的调控,此研究有利于理解Qnr蛋白的原始功能。 材料与方法：大肠埃希菌GWl000,含有recA411基因,编码的RecA蛋白酶更容易被激活；大肠埃希菌AB1157,具有完整的SOS调控系统；AB1157LexA300::spec,其LexA蛋白有缺陷,不能与LexA结合位点结合；DM49,其LexA蛋白不能被蛋白酶水解。将qnrB1、qnrB2、qnrB3、qnrB4质粒和qnrA1、qnrS1质粒导入大肠埃希菌GW1000或J53,并测定不同温度下环丙沙星对这些菌株的MIC。以环丙沙星或丝裂霉素为诱导剂,用实时定量PCR方法检测qnr基因在诱导情况下的表达。在LexA蛋白有缺陷的菌株中重复诱导表达实验。使用管家基因mdh为实时定量PCR内对照。 结果：含有不同亚型的qnrB质粒的GW1000菌株在培养温度从21℃升高到43℃时,对环丙沙星的敏感性降低2到8倍。含有qnrA1和qnrS1质粒的GW1000在温度升高时有2到3倍的敏感性降低。在具有野生型的SOS调控系统的大肠埃希菌J53中,温度升高时细菌对环丙沙星敏感性降低2倍。上述现象提示qnrB在SOS系统调控之下。qnrB在大肠埃希菌J53(具有完整的lexA和recA基因)中表达可受到诱导因素(环丙沙星、丝裂霉素)影响上升2.1至9.9倍,而qnrA1的表达则不受诱导。在含有野生型lexA和recA基因的大肠埃希菌AB1157内,qnrB4的表达也可被环丙沙星和丝裂霉素诱导,但是在LexA蛋白变异的ABll57LexA300::spec和DM49菌株内则不能被诱导。 结论：与qnrA和qnrS不同,质粒上的qnrB基因在SOS系统调控之下,qnrB的诱导表达需要完整的SOS系统。 研究背景：因为霍乱弧菌对很多抗菌药物的耐药上升,在很多地区,环丙沙星用于治疗霍乱弧菌感染。但是随着时间的推移,霍乱弧菌对环丙沙星敏感性下降,环丙沙星的临床疗效随之降低。我们对一个腹泻中心分离的霍乱弧菌耐药机制进行了研究,以明确qnr基因在耐药性形成过程中的影响。材料与方法：霍乱弧菌来源于一个腹泻研究国际中心2002至2008年的临床分离菌株。随机选择了16株对环丙沙星的敏感性水平不同的霍乱弧菌,首先用Etest测定氨苄西林、环丙沙星、庆大霉素、左氧氟沙星、萘啶酸、链霉素、四环素、甲氧苄啶和甲氧苄啶／磺胺甲基异噁唑对这些菌株MIC。应用PCR检测喹诺酮类耐药决定区突变和已知的质粒介导喹诺酮类耐药基因。以大肠埃希菌J53为受体菌进行接合试验。提取供体菌和接合子的质粒,以Southern印迹实验对水平传播耐药基因定位。使用反向PCR方法,对耐药基因周边结构进行分析。 结果：根据MIC水平将16株霍乱弧菌分为3组,第一组(MIC 0.023-0.032μg／ml),第二组(MIC 0.38-0.5μg/ml),第三组(MIC0.5μg/ml)。第一组菌株含有gyrA突变Ser83Ile,第二组菌株和第三组菌株除gyrA突变外,含有parC突变Ser85Leu,这两种突变都位于喹诺酮类耐药决定区域(QRDR)。株第二组菌株和所有的第三组菌株含有一个新的qnrVC基因亚型,其编码的蛋白与QnrVC1相差11个氨基酸,命名为qnrVC3。qnrVC3可通过接合转移至大3肠埃希菌。将qnrVC3克隆至表达载体pQE60并转化至大肠埃希菌J53可使其环丙沙星的MIC上升16-32倍。提取qnrVC3阳性的霍乱弧菌全基因组DNA对qnrVC3进行Southern印迹,对qnrVC3的周边结构进行测序,发现qnrVC3位于染色体的整合接合元件上(integrated conjugative element, ICE)。 结论：霍乱弧菌对喹诺酮类药物耐药水平逐渐上升与喹诺酮类靶位突变的累积和位于可移动元件上的qnrVC3基因有关,这给霍乱的抗菌治疗带来了更大的挑战。