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功能化多孔纳米材料的设计合成及其在蛋白质组学分析中的应用

钱昆  
【摘要】: 相比于传统的纳米材料,具有可调结构、性能的纳米多孔材料展示出非凡的特性。由于尺寸匹配,具有大孔径、高孔容的多孔材料开创了面向生物大分子的应用新方向,而孔径大于50纳米的大孔材料具有极快的传质过程和蛋白分子吸附固定速率,有潜力在蛋白质组学分析及酶反应研究中发挥巨大的优势。迄今为止,大孔材料应用于蛋白质组学分析研究仍然罕有报道,而纯硅组分的多孔材料在功能化应用中也受到了极大的限制。因此,大孔纳米材料的功能化设计合成对于其在蛋白质组学分析中的应用至关重要。 本论文第一章首先回顾了纳米多孔(大孔)材料的制备合成及表征;随后讨论了纳米多孔材料的生物应用,主要集中在基于生物质谱的蛋白质组学研究;本章将进一步介绍具体研究领域包括固定化酶技术,蛋白质翻译后修饰等。最后,我们将阐述本论文的选题意义,然后提出贯穿全文的基础概念和技术路线。 在第二章中,我们发展了一种以大孔材料作为固体催化剂来加速生物酶解反应的新路线。通过直接将有序大孔二氧化硅泡沫材料(MOSF,孔径约为100纳米)加入到常规酶解体系中,无需任何预处理和使用高浓度的酶,即可极大的提高酶解反应效率,将时间由12小时缩短到30分钟。利用该技术,可以在半小时内实现超低浓度的肌血球蛋白(2ng/μL)的酶解,其效果与溶液过夜酶解相当。同时,我们通过对大孔氧化硅泡沫材料表面进行氧化镁修饰实现了对固体催化剂表面电荷的调变,通过材料与蛋白之间的静电相互作用完成了可控的选择性酶解。带负电的氧化硅材料可以有效的催化碱性蛋白的酶解,而带正电的氧化镁修饰大孔材料则对酸性蛋白的酶解具有良好的催化效果。因此综合利用由大孔氧化硅和氧化镁修饰的氧化硅材料组成的混合催化剂可进一步提高对复杂蛋白样品的酶解效率。这种技术已经成功应用于复杂生物样品的分析并鉴定出293个蛋白质,而传统的溶液酶解技术仅鉴定出100个蛋白。由此可见,这种基于固体催化剂的新型快速酶解路线在蛋白质组学研究中拥有巨大的潜力和应用价值。 第三章中,我们制备了一种新型的多功能纳反应器Al-MOSF,并研究了其在磷酸化肽段分离富集中的应用。通过在MOSF材料表面引入氧化铝物种,得到了一种可以同时实现磷酸化蛋白质、肽段分析的复合纳反应器Al-MOSF。首先,由于Al-MOSF具有较大的孔径和孔容,其对蛋白质分子有着快速的吸附速率和较高的固定容量,因此将Al-MOSF直接分散在标准的酶解体系中,酶和底物分子可以被快速富集到材料的纳米孔道中,形成局部的超高浓度以进行高速有效的蛋白质水解反应;其次,由于氧化铝物种与磷酸化官能团的化学共价键作用,Al-MOSF材料可以直接收集靶向的酶解产物——磷酸化肽段,而绝大多数非特异性的肽段则被直接释放到空白溶液体系中。相比于传统的磷酸化分析路线,我们将12-24小时的溶液预先酶解过程缩短到了30分钟,且不需要进行任何复杂的磷酸化肽段后富集处理步骤,通过纳米功能化反应器Al-MOSF,我们成功在30分钟内完成对蛋白质的快速酶解和对磷酸化肽段的选择性分离富集,极大的简化了传统的富集分离过程。我们进一步将这种新型的纳米反应器Al-MOSF成功应用于极低的检出限(蛋白浓度2ng/μL),并在复杂生物样品的分析中验证了其应用性能。 第四章中,我们研发了一种用于糖基化物种分离富集和糖蛋白分析鉴定的多功能化纳米元器件。通过对大孔泡沫氧化硅材料(B-MOSF)表面进行硼酸物种修饰,我们得到了具有糖基团耙向性的纳米反应器,而通过进一步联用氨基修饰的大孔材料(NH2-MOSF)与无修饰的大孔材料(MOSF),我们可以提高B-MOSF纳米反应器的选择性,从而在强干扰背景下实现有效的糖蛋白分析。因此,功能化的大孔材料可以将快速的蛋白质酶解和选择性的富集糖肽集合到一步完成,并通过材料优化组合实现选择性的提高。在这种多功能化的纳反应器件概念的基础上,我们可以设计合成更多类型的智能化纳米元器件,并应用于纳米材料设计合成、酶反应研究和现代组学分析中。


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