肝星状细胞活化在早期放射性肝损伤中的作用

【摘要】： [背景与目的] 我国肝癌发病率很高,放射治疗是不能手术切除肝癌治疗的有效手段之一。放射性肝病(radiation-induced liver disease, RILD)是制约肝内肿瘤剂量递增的主要因素。RILD形成的具体机制仍不明确,越来越多的研究结果显示放射诱导肝脏非实质细胞如肝窦内皮细胞、肝枯否细胞及肝星状细胞的损伤可能在RILD发生、发展中扮演重要作用。肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)在肝脏化学或物理损伤中的主要效应细胞,通过产生细胞外基质(ECM)参与肝脏的损伤修复。放射诱导HSC活化情况及其在RILD中作用,目前相关报道还比较少。转化生长因子β1 (TGF-β1)是RILD发病中研究较多关键细胞因子之一,TGF-β1一方面刺激HSC的活化,另一方面也是HSC活化后发挥生物学效应的重要因子。本实验拟探讨放疗对HSC活化的影响及其与早期RILD的相关性,并试通过Ⅱ型TGF-β受体阻断TGF-β1信号通路观察其对RILD的影响,探索减轻或预防RILD的可行方案。 [材料与方法] 1.体外实验：HSC-T6细胞株,分为照射组与对照组,对照组细胞未经照射,照射组细胞单次照射30 Gy,分别于照射后24、48、72小时取标本。刮取细胞检测目的基因a-SMA的mRNA, ELISA方法观察细胞培养液变化。 2.动物实验及放射性肝损伤模型的建立：雄性SD大鼠70只,随机分为对照组、模型组和干预组共3组,RILD模型组大鼠肝脏局部电子线照射建模,干预组为照射并使用携TGF-βRII可溶性重组腺病毒腹腔注射1ml(1×1011)病毒数,对照组无照射无干预。于放疗后4周、6周分别取材。显微镜下观察照射野内肝组织病理切片,HE染色统计RILD损伤程度评分,同时免疫组织化学染色观察各组标本α-平滑肌动蛋白(a-SMA)、TGF-β1、纤连蛋白(FN)、Ⅰ型胶原蛋白(Col-Ⅰ)的表达量,荧光实时定量PCR法观察TGF-β1、FN表达情况,Western Blotting检测各组α-SMA、FN、Ⅰ型胶原蛋白(Col-I)表达量。 [结果] 1.体外实验HSC-T6细胞株：照射组照射后48、72小时,与对照组比较,α-SMA的nRNA表达均明显上调(P0.01)；照射组72小时与48小时对比,α-SMA表达也上调(P0.05)。照射组照射后24小时与对照组对比,α-SMA的mRNA表达无统计学差异(P0.05)。ELISA检测照射组照射后48、72小时,TGF-β1浓度均较对照组TGF-β1浓度升高(P0.05)。 2.体内实验SD大鼠： 照射后4周、6周模型组大鼠肝脏中均见到不同程度的肝细胞及小叶结构破坏、炎症细胞浸润,表现为急性炎症反应。照射后4周、6周干预组急性炎症反应程度较模型组为轻。RILD病理评分,照射后4周时模型组与干预组病理评分均较对照组升高,6周时模型组病理评分均较4周组模型组升高,而6周时干预组较模型组相比病理评分降低,差异有统计学意义(P0.05)。免疫组化观察统计显示照射后4周、6周时模型组的TGF-β1、α-SMA、FN及Col-I表达较对照组明显增多,干预组的a-SMA、TGF-β1、FN及Col-I表达较模型组减少,差异有统计学意义(P0.01)。荧光实时定量PCR提示：照射后4周和6周,模型组、干预组的TGF-β1、FN的mRNA表达较对照组均有升高,照射后4周和6周的干预组FN的mRNA表达均较模型组减少,差异有统计学意义(P0.05)。Western Blotting结果示照射后6周,干预组的a-SMA、FN的蛋白表达相比较模型组明显减少(P0.01)。 [结论] 体外研究显示射线促进非实质细胞HSC-T6细胞株的活化。HSC活化后释放的细胞外基质FN和Col-I等与早期RILD形成密切相关。TGF-β1既是HSC激活的关键因子,又是HSC活化后发挥生物学效应的主要效应因子,阻断与抑制TGF-β1通路有望成为RILD干预的靶点。