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菲降解菌分离鉴定、降解基因克隆与表达及菲跨膜作用研究

赵和平  
【摘要】: 本文通过选择性富集培养,从上海炼油厂附近污染土壤中分离到两株菲降解细菌,及一株可加速菲降解菌的菲降解速率的细菌,并对所分离菌株进行了生化鉴定以及系统发育研究,同时进行了降解特性、代谢途径、降解基因克隆及表达方面的研究,对菲的膜毒性机制进行了初步的探讨性研究。以期为建立有效的菲污染预警指标体系和PAHs污染的生物修复提供有益的参考。 本研究所获主要结论如下: 1、从石油污染土壤中筛选分离到两株菲降解菌株,分别命名为ZP1和ZP2菌株,同时分离到一株可加速菌株ZPl对菲降解速率的菌株,命名为ZP5菌株。通过革兰氏染色、细菌形态学观察、生理生化测试、抗生素抗性实验、碳源利用实验、全细胞脂肪酸分析、G+C mol%含量分析以及16S rDNA序列同源性分析,证明ZP1、ZP2和.ZP5菌株这三株菲降解细菌应分别属于鞘氨醇单胞菌属、假单胞菌属及tistrella属。其中菌株ZP1被鉴定为少动鞘氨醇单胞菌种(Sphingomonaspaucimobilis)的又一菌株,ZP2被鉴定为施氏假单胞菌种(Pseudomonas stutzeri),这是首次报道施氏假单胞菌种菌株具有菲降解活性。 2、ZP1和ZP2两株菲降解菌都有很好的温度、pH及菲含量适应性。少量蛋白胨、酵母膏及葡萄糖的加入可不同程度的加速两株菌对菲的降解;氯化铵、硝酸铵和硫酸铵为氮源时对这两株菌的菲降解速率几乎没有影响;菲浓度范围从250 ppm到1000 ppm之间,ZP1和ZP2菌株都可良好生长并快速降解菲;表面活性剂Brij 30和Trition 100在低浓度时对ZP2菌降解菲的速率有促进作用,但对ZP1菌株的菲降解作用有明显的抑制作用,Tween 80在实验的三个浓度梯度中对ZP1和ZP2均表现出一定的加速菲降解速度效应。 3、酶活实验证明,ZP1和ZP2菌株都有较高的1,2.邻苯二酚双加氧酶2,3-邻苯二酚双加氧酶活性,特别是2,3-邻苯二酚双加氧酶活性。在两个菌株的菲代谢过程中,都发现了邻苯二甲酸代谢途径中的关键代谢产物1-羟基-2-萘甲酸和2-羟基-1-萘甲酸及邻苯二甲酸,所以推测两个菌株都是经过邻苯二甲酸途径利用菲为碳源而实现对它的降解。 4、根据己知序列设计引物在菌株ZPl中扩增得到芳香环经化双加氧酶铁硫蛋白α大亚基编码基因,命名为pha-ZP1,其在Genbank登陆号为EU082776,该基因全长1287bp,编码383个氨基酸。利用Cn3D4.1软件和Swiss Model Workspace网络工具(http://swissmodel.expasy.org)推导蛋白质三维结构,结果显示其具有Rieske型[2Fe-2S]中心和单核铁原子结合域这两个在酶的催化功能上具有重要作用的保守结构。并且其氨基酸序列与来自Sphingomonas yanoikuyae B1和Sphingomonasr sp.P2的铁硫蛋白α亚基同源性高达97%。 5、根据已知序列设计引物分别在菌株ZP1和ZP2中扩增得到了各自的邻苯二酚双加氧酶基因,分别命名为phn—ZP1和phn-ZP2,它们在Genbank中的注册登陆号分别为:EU082777和EU082777。利用Cn3D4.1软件和Swiss Model Workspace网络工具(http://swissmodel.expasy.org)推导了基因所编码蛋白质的三维结构。通过与已知基因序列和编码氨基酸序列的比对,对两段基因进行了遗传亲缘分析。ZP1菌株C230基因phn—ZP1全长797bp,编码233个氨基酸,其二级结构主要为α螺旋和B链结构,phn—ZP2基因全长1047bp,编码331个氨基酸,其二级结构同样主要为α螺旋和β链结构。 6、通过基因重组将菌株ZP2的邻苯二酚2,3-双加氧酶编码基因phn—ZP2在Rosetta进行了成功表达,初步检测结果显示,重组菌株的酶表达活性要明显高于出发菌株。 7、卵磷脂脂质体作为模拟细胞膜被用来研究PAHs的跨膜特性和膜毒性。结果显示,此类亲脂性有机物在跨膜的过程中符合Nernst分配定律。从而可以计算出菲在卵磷脂脂质体和水之间的分配系数。研究了离子强度、温度、酸度等条件对分配作用的影响。此外,首次研究了菲在卵磷脂微囊与模拟细胞液之间的反分配作用。文中利用大肠杆菌及菲降解菌ZP1进一步研究了菲在不同细菌上的跨膜作用。实验表明相对于大肠杆菌,菲更容易进入降解菌的细胞膜内,而展开进一步的降解;在膜上的累积从而导致膜通透性的降低,是芳香环类有机物表现毒性的可能原因;亲脂性有机物菲通过分配作用富集到磷脂层,然后通过反分配作用从磷脂双分子层进入到细胞液,从而最终影响细胞的活性和功能。由以上实验得出跨膜屏障.结构效应(TBSE)理论,从而很好的解释了有机物跨膜过程的行为和膜毒性。


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