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细菌中一种黄素依赖型单加氧酶的克隆表达及催化机制研究

王镇轩  
【摘要】:黄素依赖型单加氧酶(FMO,E.C.1.14.13.8)是除了细胞色素P450(CYP450,E.C.1.14.14.1)之外,人类代谢系统中最重要的单加氧酶系统之一,它与外源物的代谢及毒物的多种应答有关。与真核生物的基因组中的FMO相比,细菌的FMO相对稀少,仅仅鉴定到一些典型的FMO。原核生物中第一种鉴定过的FMO蛋白(bFMO)来自噬甲基菌SK1(Methylophaga sp. strain SKI)中,得到可溶性FMO蛋白的X射线结构能够在2.6埃的分辨率上得以呈现。 所有哺乳动物的FMO对细胞膜都有着很强的结合,且蛋白水溶性很低,而目前为止没有得到过任何哺乳动物的FMO晶体结构。细菌中的FMO则不存在此类问题,从而更适合于实际应用。又因其区域选择和手性催化,以及稳定性好等特点,在异源生物质代谢、药代动力学和生物催化合成等领域受到了广泛的关注。 本课题从原油污染的土壤样品中建立宏基因组文库,分离到一种能使吲哚变蓝的转化子,我们将此功能的fmo基因命名为bfmoⅡ。生物信息学分析表明,bFMOⅡ与之前研究过的bFMO存在着许多差异性,体现在密码子的使用偏好性不同等。序列比对表明,bFMOⅡ的许多结构与已结晶过的FMO蛋白有着很大相似性。系统发育树的构建,证实了原核生物中FMO存在的多样性,这为以后相应研究的进一步开展打下了基础。 通过将基因连入克隆载体pMD18-T,导入大肠杆菌DH5α,能将LB培养基中由宿主菌代谢生成的吲哚,进一步转化成生物靛蓝,并对生物靛蓝产量做了初步测定;通过将基因连入载体pET-28a,导入到大肠杆菌BL21(DE3)中,能将吲哚及吲哚类衍生物转化成不同色素,为之前未曾证实过的。 本研究建立了一套完整的bFMOⅡ蛋白诱导表达及纯化的方案。在通过对bFMOⅡ蛋白诱导条件的选择,确定了以含质粒pET-28a-FMO的大肠杆菌BL21(DE3)的酶表达体系。优化了诱导表达条件,实验选择了低温诱导(16℃),低浓度的诱导物(终浓度为0.3 mM IPTG),温和的表达环境(130 rpm),经过对诱导后菌体细胞的破壁,得到了大量的可溶性蛋白,为后续蛋白的纯化打下了基础。在酶的分离纯化过程中,通过实验摸索,发现了硫酸铵沉淀为酶纯化过程的关键。通过硫酸铵沉淀,将破壁后的粗酶液中的bFMOⅡ蛋白进行了初步的捕获,得到了满意的实验结果,获得了均质的bFMOⅡ。 对纯化后的bFMOⅡ的基本性质进行了研究。通过非变性凝胶电泳得知bFMOⅡ活性状态下,分子量大小约为110 kDa,为同型二聚体,单体分子量约为55 kDa。通过对酶纯化过程中的颜色及对纯酶的全波长扫描,发现bFMOⅡ内含有非共价结合的辅因子FAD,且在纯化过程中容易丢失。通过bFMOⅡ的辅因子定量分析得知,酶中的一个亚基需要结合一个辅因子FAD。 对bFMOⅡ设计了四个可能存在的关键位点,并进行了点突变及活性验证。通过观察突变体对吲哚转化的直接影响,确立了快捷的突变体活性检测方法。结果说明,实验所设计的四个位点相对应的氨基酸残基,对bFMOⅡ的活性起着重要的活用。通过同源建模,对bFMOⅡ及同位点的两个bFMOⅡ突变体构建了模型,并对模型结果进行评估,得到了理想的结构。通过对结构中部分突变位点处结构的模拟对比,从理论上初步推测了酶失活的机制。


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