色素万寿菊psy双边界载体及遗传转化体系建立和SSR-PCR体系的优化

【摘要】：万寿菊（Tagetes erecta L.）不仅是重要的园林花卉，具有极高的观赏价值，而且花是提取叶黄素的优质材料，具有很高的经济价值。本研究以色素万寿菊雄性不育两用系为材料，根据gus基因瞬时表达的情况，建立根癌农杆菌介导的以万寿菊下胚轴为外植体的遗传转化体系，通过分子标记和PCR技术，对色素万寿菊雄性不育两用系的SSR-PCR体系进行优化，同时构建叶黄素代谢途径中关键酶基因psy的双边界表达载体，为获得高叶黄素含量的万寿菊转基因品种奠定基础，本研究结果如下： (1)建立了色素万寿菊雄性不育两用系遗传转化体系。 根据gus基因瞬时表达的情况，优化了遗传转化条件，建立了根癌农杆菌介导的遗传转化体系。遗传转化的最佳条件为：外植体为下胚轴，预培养2d，农杆菌浓度OD600=1.0，1/2MS0悬浮，1/2MS0悬浮液和共培养培养基中AS浓度为100μmol/L，侵染采用80W、5min的超声波处理后，黑暗共培养2 d。 (2)构建了叶黄素生物合成途径中关键酶基因psy的双边界载体。 提取万寿菊花总RNA，RT-PCR获得cDNA，根据GenBank中万寿菊psy的编码序列设计特异引物，PCR扩增psy将其连接到双边界载体上，从而得到了植物表达载体，并采用“冻融法”将重组质粒转入农杆菌EHA105菌株中。 （3）对色素万寿菊雄性不育两用系的SSR-PCR体系进行优化。 以色素万寿菊雄性不育两用系为材料，通过对SSR-PCR反应体系中的主要因素dNTPs、引物及模板DNA进行最优条件筛选，建立了适合于色素万寿菊雄性不育两用系的SSR-PCR反应体系：2.5μl10×buffer、40 ng模板DNA、2μl 10μM/μl引物、1.0 U Taq酶、1.2μl2.5mM/μl dNTP，ddH2O补足体系至25μl；PCR循环程序为：94℃预变性2 min; 38个循环（94℃变性30 s、56℃退火30 s、72℃延伸1min），72℃延伸10 min。