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茄子花青素生物合成关键基因的克隆与表达分析

李翔  
【摘要】:茄子是我国重要的蔬菜作物。近年来,关于茄子花青素方面的研究日益深入,对于茄子的花青素的类型,抗氧化效果都有了深入研究。因此进一步研究茄子花青素的生物合成路径,寻找茄子不同资源间花青素含量差异性的机理,可以为深入发掘茄子的保健作用,提高茄子育种品质等方面的工作提供理论基础。 我们采用了两种表型差异明显的茄子资源,表型为紫茎,紫花,紫果的云南紫长茄和表型为绿茎,白花,白果的云南圆白茄作为实验材料。通过研究14个与花青素合成有关基因在云南紫长茄和云南圆白茄商品成熟期的果皮中的表达情况,发现了二氢黄酮醇4-还原酶基因(SmDFR)和花青素5-O糖苷转移酶基因(Sm5GT)的表达差异。进而克隆了茄子中SmDFR和Sm5GT基因的cDNA全长。 SmDFR的cDNA长度为1503bp,编码区从87-1235共1149bp,推导编码383个氨基酸。云南圆白茄中的SmDFR(YRWSmDFR)的核苷酸序列相比于云南紫长茄的SmDFR(YLPSmDFR)有两个位点的突变,核苷酸序列632位的突变为同义突变,792位的突变为错义突变,使得YRWSmDFR氨基酸序列在236位由赖氨酸变为了谷氨酸。SmDFR推导的氨基酸序列具有典型的NADPH结合基序和底物结合基序,在决定酶活性的145位点,SmDFR为天冬氨酸。SmDFR在云南紫长茄和云南圆白茄中的表达具有很大差异。在云南紫长茄的所有紫色组织中,YLPSmDFR的表达量要显著大于云南圆白茄相同组织的YRWSmDFR。通过southern杂交,SmDFR在云南紫长茄和云南圆白茄中均为单拷贝。将YLPSmDFR和YRWSmDFR分别进行原核表达,检测融合蛋白对二氢山奈酚,二氢檞皮素和二氢杨梅素三种底物的活性。YLPSmDFR和YRWSmDFR对于二氢杨梅素的活性均大于二氢檞皮素和二氢山奈酚,同时YLPSmDFR对于二氢杨梅素的活性要明显大于YRWSmDFR。这些结果表明,SmDFR可能是造成茄子花青素差异的关键基因,并且YRWSmDFR在236位的突变可能进一步的削弱了酶活性。 Sm5GT的cDNA长度为1789bp,编码区从67-1479共1413bp,推导编码470个氨基酸。推导氨基酸序列具有典型的5GT底物结合基序。Sm5GT在云南紫长茄和云南圆白茄中的所有检测组织中都有表达,但在云南紫长茄的紫色花瓣和商品期紫色果皮中的表达量略大于云南圆白茄。这个结果表明Sm5GT可能具有较广泛的底物范围。


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