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毛细管等电聚焦/加压毛细管电色谱多维联用及其在多肽蛋白质分离中的应用

魏娟  
【摘要】:随着人类对生命体系探究的不断深入,对分析分离工具和方法的需求日渐迫切。发展二维或者是多维的高效、高分辨率和高峰容量的分析技术已经成为从根本上解决复杂体系分离问题的方法之一。尤其是随着蛋白组学研究的推进,缺乏专门针对蛋白质、多肽等生物样品的高效分离平台已经成为制约其发展的瓶颈。本研究基于毛细管等电聚焦(cIEF)与加压毛细管电色谱(pCEC)正交的分离机理,以搭建cIEF/pCEC二维分离系统为研究方向,分别对cIEF和pCEC单维以及离线和在线cIEF/pCEC二维体系搭建中的关键内容、相关技术进行了系统的研究和讨论。首次实现了cIEF和pCEC的联用分析,该二维体系从样品的等电点、疏水性、分子量和带电荷情况等方面进行多重定位,实现了对复杂蛋白质/多肽样品的高效全多维分析。证明了该二维分离体系在复杂生物样品分离中超强的分离能力和广阔的应用前景,有望成为蛋白质组学研究的重要工具。为今后cIEF-LC、CE-pCEC的联用提供了新的思路,为针对蛋白质/多肽复杂样品的多维分离研究提供了强有力的技术基础。 本论文共分为五章,主要内容包括: 第一章分别从方法、原理,检测方法以及应用等方面综述了cIEF和pCEC相关的研究背景。同时介绍了多维分离方法的理论依据,总结了多维液相色谱(MDLC),液相色谱-毛细管电泳(LC-CE),二维毛细管电泳(2D-CE)等联用技术的进展,并对cIEF及pCEC相关的多维研究现状分别进行详述。 第二章建立了一步法cIEF分离蛋白质和多肽的方法。对毛细管壁涂层方法、两性电解质的浓度、聚焦电压、添加剂等关键因素进行优化,建立了一种高效的分离两性物质的一步法cIEF。本文建立的羟丙基纤维素(HPC)涂层,100次重现性良好。与未涂层的毛细管相比,对酸性蛋白质的分离有明显改善。另外对这种cIEF方法进行重现性的考察,6种标准蛋白质分离的日内精密度均小于4%,日间精密度以及批次重现性的RSD都在4-12%之间。该方法稳定可靠,操作简便,重现性好,具有很强的聚焦能力,在优化的条件下可以实现对复杂多肽和蛋白质样品的高效分离。 第三章则对pCEC分离多肽的条件进行了探讨,本章以牛血清白蛋白(BSA)的酶解多肽为样品,主要对洗脱梯度、工作电压以及分离的重现性进行优化和考察。实验结果表明随着电压的升高,电场强度增强,样品保留时间缩短,分离速度提高。-6 kV的工作电压下,比不加电时对肽段的分离在分辨率、柱效以及峰容量上都有所改善。 第四章在前两章研究的基础上,对cIEF/pCEC二维离线系统构建中的关键问题进行优化。一步法的cIEF方便了样品迁移,使二维过程更易行。第一维毛细管柱末端的电隔离槽装置,方便了样品的收集,保证了实验的安全。以BSA的胰蛋白酶解肽段对该二维平台进行评价,通过全多维分析共检测到大约300个肽段,理论峰容量约为36000。比单维分离的方法,总峰容量和整体分离能力都得到了很大的提升。将cIEF/pCEC二维系统应用在人血红细胞破碎液(HRBCL)的蛋白质和酶解多肽的图谱构建中。建立了可靠的cIEF/pCEC离线分离体系,为搭建在线cIEF/pCEC二维平台奠定了坚实的基础。 第五章在离线分离的基础上,以电隔离槽和六通阀作为接口搭建了cIEF与pCEC在线二维联用平台,并用BSA酶解多肽进行评价。同时将其应用在HRBCL及其胰蛋白酶裂解液的研究中,证明该系统不仅可以用于复杂多肽样品的分离,而且对复杂的生物大分子也可以实现很好的分离。同时与后一维不加电的cIEF/μHPLC相比,发现cIEF/pCEC联用系统对样品的分离柱效更高,分离速度更快,在整个分离效果上有非常明显的改善。 本论文对cIEF/pCEC联用系统进行了研究,分别首次构建了离线和在线联用体系,并实现了对复杂蛋白质和多肽样品的高效分析。cIEF的聚焦能力和pCEC的双重分离机制使该二维系统在分离复杂生物样品中具有独特优势,为复杂生物样品的分离提供了一种新颖有效的分离工具,为今后cIEF及pCEC的多维联用研究打下了坚实的基础。


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