收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

副溶血弧菌高通量分子检测方法的建立与基因分型研究

陈万义  
【摘要】:副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是一种革兰氏阴性嗜盐杆菌,主要存在于近岸海水、海底沉积物和鱼、虾以及贝类等海洋生物中,人类食用了含有该菌的生的或者未煮熟的水产品能引起食物中毒、反应性关节炎和心脏疾病。此外,它还严重危害了水产养殖业的发展。因此,了解副溶血弧菌在水产品中的分布特征以及建立快速、灵敏的检测方法对于食品安全监控具有重要意义。 本课题主要对副溶血弧菌在水产品中的分布特征、基因分型以及快速检测技术进行了比较深入的研究,主要研究内容和结果如下: 1.副溶血弧菌多重PCR检测方法的建立及评价 利用本地BLAST序列比对分析方法挖掘到副溶血弧菌新的种特异性基因,即D型氨基酸脱氢酶小亚基基因(D-amino acid dehydrogenase, small subunit, aadS),根据该基因设计用于PCR检测的特异性引物,并对引物的特异性和灵敏度进行了系统的生物学评价,证实该基因特异性强,灵敏度高,能够作为副溶血弧菌分子检测的靶点。另外,结合毒力因子耐热直接溶血素(tdh)和tdh相关溶血素基因(trh),建立了副溶血弧菌多重PCR检测方法,并对该方法进行了系统评价。该多重PCR方法特异性为100%,基因组DNA检测灵敏度为20 fg/PCR。将该方法应用于55份实际样品(虾,鱼和牡蛎等)的检测,通过与传统国标方法进行比较,发现有一份样品用国标检测为阳性,而该多重PCR方法检测为阴性,其它样品检测结果都与传统方法一致。表明本课题建立的副溶血弧菌多重PCR检测方法具有快速、特异性强和灵敏度高等优点,可用于水产品和临床样本的快速检测,同时可对分离菌株是否具有致病性能够进行初步判断。 2.基于单碱基延伸标签法的基因芯片检测方法的建立 在多重PCR基础上建立了基于单碱基延伸标签法(SBE-TAGS)的基因芯片检测方法,并可用于水产品中副溶血弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、哈维氏弧菌和鳗弧菌的同时检测。利用三组多重PCR实验同时扩增7种水产致病弧菌9个特异性检测靶基因。根据aadS, tdh和trh基因的检测结果来判断水产品中是否含有副溶血弧菌及其是否具有致病性;依据col, toxR和vvh基因分别检测溶藻弧菌、拟态弧菌和创伤弧菌;采用empA, vhh1和tcpA基因依次检测鳗弧菌、哈维氏弧菌和霍乱弧菌。纯化后的多重PCR产物进行单碱基延伸反应后被标记上荧光染料Cy3,标记后的产物进行芯片杂交、信号扫描和结果分析。结果表明,该基因芯片检测特异性为100%,检测灵敏度为200 fg/PCR~20 pg/PCR。将该方法应用于55份实际水产样品的检测,发现有18份样品同时含有副溶血弧菌和溶藻弧菌;通过与传统国标方法进行比较,发现除一份样品与传统方法检测结果不同外,其它样品检测结果均为一致。该方法的建立不但可以保障为消费者提供更加安全的水产品,还有利于水产养殖业的健康发展。 3.副溶血弧菌在水产品中分布特征及多样性分析 利用国家标准方法和PCR方法相结合的手段,在2006年4月至2009年6月之间,从上海地区水产品批发市场、零售市场以及大型超市合计取样368份。从上海地区215份样品中分离到47株副溶血弧菌,分离率为21%;从进口的153份样品中分离到56株副溶血弧菌,分离率为37%。对分离菌株进行毒力基因PCR检测和尿酶实验测定,发现上海地区副溶血弧菌分离菌株中有2株(2/47,4%)含有tdh基因但不含trh基因,且尿酶实验均为阴性。进口样品中副溶血弧菌分离菌株有4株(4/56,7%)携带tdh基因,其中有一株菌株(1/56,2%)既含有tdh基因,又含有trh基因,尿酶实验也为阳性,其余菌株尿酶均为阴性。经O抗原测定,发现上海地区副溶血弧菌分离菌株O抗原主要为O1和O2,其中O1有14株(14/47,30%),O2有10株(10/47,22%)。进口样品中副溶血弧菌分离株O抗原主要为O10和O2,其中O10有13株(13/56,23%),O2有10株(10/56,18%)。为了了解不同地区分离菌株之间的相关性,将103株副溶血弧菌食品分离菌株和上海地区5株常见的不同血清型的副溶血弧菌临床分离菌株同时经过肠杆菌基因间重复序列PCR(ERIC-PCR)分型,利用数学软件BioNumercis version 5.0根据非加权算术平均数聚类法(UPGMA)对分型结果进行处理和分析,如果按相似性值大于0.70,所有分离菌株被分成44个类群,发现有4株上海地区样品分离株(SJTUF30004, SJTUF30013, SJTUF30025和SJTUF30037)和6株进口样品分离株( SJTUF30083, SJTUF30086, SJTUF30089 ,SJTUF30090,SJTUF30094和SJTUF30102)与临床致病菌株聚在一起,表明这10株分离菌株与临床分离株在基因水平存在较高的相似性,据此推测它们具有潜在的致病可能性。 4.副溶血弧菌基因分型及菌株相关性分析 鉴于副溶血弧菌在我国沿海地区引起的食物中毒事件频频发生,因此迫切需要对该菌传染源的感染地点和流行毒力菌株做出快速正确的鉴定和确认。本研究以上海及周边地区流行病学上不相关的56株分离菌株(2006年至2008年)为研究对象,这些菌株同时经过四种基因分型方法进行分析,包括ERIC-PCR、核糖体分型、脉冲场凝胶电泳(PFGE)和gyrB基因序列分析分型。四种分型方法结果通过数据处理软件Bionumeircus version 5.0根据非加权算术平均数聚类法(UPGMA)进行聚类分析和分子进化树的构建,聚类结果显示,每种分型方法得到的结果并不完全一致,而且差异较大。根据相似性值大于0.76,按辛普森方程计算每种方法的分辨率(D值),ERIC-PCR、PFGE、核糖体分型和gyrB基因的序列分型的分辨率依次为0.942、0.907、0.756和0.702。由于核糖体分型的分辨率较低,说明它不太适合用于同一地区副溶血弧菌分离菌株之间的亚种分型。四种方法聚类分析的结果同时发现,两株食品分离菌株F13和QS2均和致病菌株聚成一类,反映出它们和致病菌株之间的亲缘关系较近,具有潜在的致病可能性。通过对56株副溶血弧菌分离株的基因分型研究,发现ERIC-PCR和gyrB基因序列分析联合起来使用,不但具有较高的分辨率(D=0.966),而且还可以快速比较不同来源的副溶血弧菌分离菌株之间的相关性。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 毕水莲;李琳;张学武;石磊;;Sau-PCR和AILP技术对一起副溶血弧菌引起食物中毒的分型研究[J];食品工业科技;2009年09期
2 李素华;;潮州市细菌性腹泻与副溶血弧菌的关系[J];中国公共卫生;1987年04期
3 黄上媛,刘永福,周志江,张维国;脲酶阳性副溶血弧菌的临床及实验研究[J];中华医学检验杂志;1995年02期
4 李研东;卢士英;任洪林;周玉;柳增善;;副溶血弧菌外膜蛋白OmpK基因的克隆及原核表达[J];中国实验诊断学;2009年05期
5 王春宴,王茵茵,虞丽琴;抗副溶血弧菌鞭毛血清的初步研究[J];上海预防医学杂志;1998年09期
6 曹严华;日本1996~1998年的副溶血弧菌感染[J];疾病监测;2000年10期
7 邱波,姚斐,王本利;产尿素酶副溶血弧菌的病原学研究[J];职业与健康;2003年05期
8 ;副溶血弧菌质粒检测[J];上海预防医学杂志;1994年06期
9 杨其元,刘均凤,孙天梅,李士永,崔树玉;尿酶阳性副溶血弧菌的分离与鉴定[J];中国卫生检验杂志;1996年01期
10 宋卫峰;;副溶血弧菌基因组序列[J];国外医学(微生物学分册);2003年06期
11 胡祺;;副溶血弧菌性肺炎[J];国际流行病学传染病学杂志;1984年06期
12 赵旺胜,张桂勤,章莉莉,孙志坚;副溶血弧菌肠道感染64例临床和药敏分析[J];南京医科大学学报;1998年05期
13 隋颖,董淑娥;一起由副溶血弧菌引起的食物中毒事故调查分析[J];中国卫生检验杂志;2004年02期
14 黄佐平;曾艳芳;陈桂玉;;一起副溶血弧菌引起食物中毒的调查报告[J];中国现代医生;2009年29期
15 金黄水;刘常谋;邓明操;王斌;钟崧庆;;一起由副溶血弧菌引起食物中毒的调查报告[J];中国国境卫生检疫杂志;1989年01期
16 张蔚;潘劲草;孟冬梅;叶榕;;2000年—2004年杭州地区副溶血弧菌分离株的PFGE和RAPD分型[J];中华微生物学和免疫学杂志;2006年10期
17 陈斯林;;一起副溶血弧菌引起的食物中毒事故调查报告[J];安庆医学;2005年04期
18 马海东,吕军,周志江;副溶血弧菌染色体DNA的限制性内切酶图谱的分析[J];肉品卫生;1994年05期
19 朱顺元,李根桦;副溶血弧菌污染同一食品连续三餐食物中毒调查[J];预防医学文献信息;1997年04期
20 李红玉,梁卓智,林君仪;霍乱弧菌和副溶血弧菌混合感染一例[J];中华检验医学杂志;1999年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 林强;李宁求;付小哲;刘礼辉;石存斌;吴淑勤;;牡蛎养殖过程中副溶血弧菌流行情况调查[A];2010年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
2 赵峰;曹慧慧;周德庆;;东部六个沿海城市零售贝类中副溶血弧菌的分布及特征研究[A];中国食品科学技术学会第七届年会论文摘要集[C];2010年
3 柯碧霞;谭海玲;李柏生;何冬梅;马聪;刘美真;陈经雕;;2009年广东省副溶血弧菌暴发与散发菌株的病原学特征分析[A];新发和再发传染病防治热点研讨会论文集[C];2011年
4 何丽斌;周宸;林克冰;;几种养殖贝类中副溶血弧菌的分离与鉴定[A];第三届全国现代生态渔业管理与技术研究[C];2011年
5 傅玲琳;励建荣;;浙江沿海地区海产品中副溶血弧菌表型及其主要毒力基因分布特征[A];中国食品科学技术学会第七届年会论文摘要集[C];2010年
6 何冬梅;朱海明;马聪;柯碧霞;方伟;谭海玲;李柏生;邓小玲;柯昌文;;广东省食源性副溶血弧菌表型特征与分子分型比较研究[A];新发和再发传染病防治热点研讨会论文集[C];2011年
7 傅玲琳;励建荣;;海产品副溶血弧菌检测与分型技术研究进展[A];中国工程院第77场工程科技论坛·2008水产科技论坛——渔业现代化与可持续发展论文集[C];2008年
8 王艺;扈庆华;牟瑾;林一曼;兰全学;石晓路;马汉武;程锦泉;杨志荣;;2007-2008年深圳市腹泻病副溶血弧菌监测及分子特性分析[A];中华医学会第一届全国公共卫生学术会议暨第四届中国现场流行病学培训项目汇编[C];2009年
9 刘梅;;MLVA、spoligotyping技术应用于结核分枝杆菌基因分型的初步研究[A];中华医学会结核病学分会2010年学术年会论文汇编[C];2010年
10 贺东生;余小利;;猪链球菌2型基因分型技术研究进展[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集(上册)[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 陈万义;副溶血弧菌高通量分子检测方法的建立与基因分型研究[D];上海交通大学;2011年
2 祝儒刚;海产品中致病性副溶血弧菌PCR快速检测体系建立及定量研究[D];沈阳农业大学;2011年
3 李建红;沙眼衣原体高分辨率溶解曲线基因分型方法的建立及其在男男性行为者流行病学调查中的应用[D];北京协和医学院;2010年
4 姜晓颖;北京地区结核分枝杆菌基因分型及与耐药性关系的研究[D];北京市结核病胸部肿瘤研究所;2012年
5 毛芝娟;副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus主要外膜蛋白的克隆、表达和免疫原性研究[D];浙江大学;2007年
6 杨雷;副溶血性弧菌的体外比较转录组学研究[D];中国协和医科大学;2009年
7 张崇文;哈维氏弧菌外膜蛋白(OmpK和GAPDH)免疫原性研究及主要海水病原弧菌外膜蛋白交叉保护性抗原筛选[D];浙江大学;2007年
8 石荔;西藏自治区结核分枝杆菌临床分离菌株的基因分型初步研究[D];四川大学;2007年
9 陈建;结核患者社会行为因素和结核分枝杆菌基因分型的初步研究[D];四川大学;2007年
10 陈鹏;基因定位方法的创新与DNA自动机硬件的研究[D];上海交通大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 陈星;副溶血弧菌毒力基因的表达变化研究[D];上海海洋大学;2011年
2 Khamphouth VONGXAY(坎布);海产品中副溶血弧菌的分子鉴定与分型[D];浙江大学;2004年
3 张建;副溶血弧菌耐热溶血毒素单克隆抗体的研究[D];上海海洋大学;2011年
4 田长冬;环介导等温扩增(LAMP)技术检测贝类中副溶血弧菌的研究[D];河北农业大学;2011年
5 李巧苹;副溶血弧菌耐热直接溶血素基因的克隆表达与鉴定[D];福建农林大学;2004年
6 代敏;副溶血弧菌的致病性分析及内标PCR检测方法的评价[D];上海交通大学;2011年
7 谭磊;基于PCR的牛源金黄色葡萄球菌基因分型研究[D];黑龙江八一农垦大学;2008年
8 曹群奋;幽门螺杆菌的培养鉴定及其基因分型方法学的建立[D];浙江大学;2007年
9 张振颖;利用核糖体基因进行孢子丝菌种内分型及一株播散型孢子丝菌的基因鉴定[D];大连医科大学;2005年
10 孙志刚;RHCE基因分型的实验性研究[D];中国医科大学;2005年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 张元跃;南宁海产品副溶血弧菌检出率高达71.4%[N];中国食品质量报;2006年
2 高晶霞记者 吴天飞;市卫生监督部门发布食品安全预警[N];哈尔滨日报;2007年
3 本报记者 周丽;如何安全应对腹泻[N];河北日报;2006年
4 ;海鲜中毒进入“高发期”[N];人民日报;2006年
5 卢维;丙肝检测添基因分型手段[N];健康报;2003年
6 韩振奎;腹泻原因各不同胡乱止泻恶果生[N];中国石化报;2004年
7 顾蓓红;基因分型抗病毒有的放矢 PEG干扰变异者难逃“罗”网[N];科技日报;2003年
8 原河北大学医学部医疗系副主任、副教授 刘照福;腹泻不可胡乱止[N];广东科技报;2006年
9 符壮才 刘嫦玉;细菌鞭毛镀银染色有新方法[N];健康报;2006年
10 朱 海  吕敬章  侯乐锡;深圳局研发成功致病菌PCR检测快速方法[N];中国国门时报;2006年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978