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拟南芥Male Sterile2控制花粉外壁形成的生化机理研究

陈伟伟  
【摘要】:花粉外壁的发育和形成对花粉成熟起重要作用。花粉外壁可以提高花粉的自我保护能力,可以使被释放的花粉抵御外界不利生物和非生物因素的危害,顺利完成传播和授粉。花粉外壁主要是由聚合的孢粉素构成,孢粉素被认为是含有聚合的酚类物质和脂肪酸衍生物的复合物。模式植物拟南芥Male Sterile 2 (MS2)被证明是控制花粉外壁合成的重要基因,该基因特异在花药绒毡层中表达,生物信息分析表明该基因是编码脂肪酰基还原酶,可能催化脂肪酸向脂肪醇的转化。但是,MS2是如何参与脂肪酸转化以及它在哪个细胞器中发挥作用等均不清楚。本文围绕MS2在花粉外壁形成机制方面开展了深入研究,取得了以下主要成果: MS2蛋白定位于花药绒毡层细胞的质体中:生物信息分析结果表明,MS2基因编码1个含有N-端信号肽(1-46aa)、1个NAD(P)H Binding Domain (NBD)以及1个Sterile Domain (SD)。为研究MS2蛋白的细胞定位,我们做了以下表达载体构建,分别是全长MS2与GFP的融合蛋白的MS2-GFP、缺失46个aa的N-端信号肽的MS2和GFP融合载体MS2ΔN-GFP、及MS2的N-端信号肽与YFP融合蛋白的表达载体TP-YFP。分别将这些表达载体瞬间转化拟南芥原生质体以及烟草叶片,瞬时表达结果表明,MS2的N-端信号肽可以将MS2蛋白定位在质体中。 为了证明MS2定位在质体中的生物学功能,我们构建了一些含有MS2启动子的MS2全长或者缺失N-端信号肽的片段和GFP融合,MS2-GFP、MS2ΔN-GFP,将MS2-GFP或MS2ΔN-GFP稳定转化野生型拟南芥以及ms2杂合子。对转基因植物分析结果表明,MS2蛋白仅在小孢子从四分体释放后的绒毡层细胞里特异性表达,缺失N-端信号肽的MS2蛋白无法像全长MS2一样互补ms2的花粉外壁发育异常的表型。我们同时还利用拟南芥Rubisco小亚基的转运肽基因片段与缺失N-端信号肽序列的MS2的融合蛋白的表达载体(RTP-MS2ΔN’)互补ms2突变体,结果表明转基因植物的部分株系花粉外壁异常发育的表型得到恢复。这些结果说明MS2在质体中的亚细胞定位于其控制花粉外壁发育的生物学功能具有十分重要作用。 NBD和SD对MS2的生物功能起到重要作用:为研究NBD以及SD结构域对MS2生物学功能的影响,我们将MS2本身的启动子与分别缺失NBD、SD的MS2序列连接,转化ms2杂合子,分析含有纯合ms2转基因植株的花粉外壁的表型,发现突变NBD或SD均不能恢复ms2的表型。说明NBD和SD对于MS2行使其生物学功能十分重要。 MS2编码一种脂肪酰基载体蛋白还原酶:为研究MS2生化机制,Doan et al.(2009)在含有MS2的重组细菌的培养基中检测到C14:0、C16:0以及C18:1脂肪醇,因此认为,MS2可能利用酰基辅酶A为底物进行脂肪醇的合成。我们将MS2在大肠杆菌中重组表达后,利用纯化的蛋白进行体外生化分析,结果表明重组MS2是一种脂肪酰基载体蛋白还原酶,在NAD(P)H或NADH存在下,能催化C16:0脂肪酸以C16:0-ACP的形式转变成C16:0脂肪醇。且其最佳的反应pH值是6.0,温度为30℃。在上述最佳反应条件下,以C16:0-ACP为底物,测得米氏常数Km值是23.3±4.0μM,Vmax值是38.3±4.5 nmol mg~(-1) min~(-1)。另外,我们对瞬间表达MS2的烟草叶片进行脂类测定,结果表明瞬间过量表达MS2的烟草叶片中,C16:0和C18:0脂肪醇有明显的积累。暗示了MS2蛋白在植物体内参与脂肪酸代谢途径中的脂肪醇的合成。 综上所述,我们认为在拟南芥花药发育的第8期到第10期,MS2可以利用绒毡层细胞质体中C16:0-ACP合成相应的脂肪醇,为花粉外壁的发育提供脂类物质,这对于解释花粉外壁合成的生化机制起到重要作用;同时这项工作也第一次证明了植物质体具有将脂肪酸到脂肪醇转化的能力,拓展了人们对质体功能的认识。


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