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siRNA沉默脊髓D型氨基酸氧化酶对慢性疼痛的抑制作用

陈晓玲  
【摘要】:D-型氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAAO)是一种以FAD为辅基的氧化酶,它在体内参与的生化反应为催化D-型氨基酸分解产生相应的α-酮酸、NH3和H2O2。先期研究通过基因敲除和化学抑制剂的方法先后证明DAAO在多种慢性疼痛中,可能发挥了作用。本研究为了进一步验证DAAO可以作为治疗慢性疼痛的靶点,选用特异性较强的RNA干扰的方法,进行如下探索: 第一,利用计算机软件设计针对DAAO的siRNA及非特异序列siRNA(阴性对照)。我们构建并包装腺病毒作为基因转运载体。以shRNA作为siRNA的前体,利用其转染进入细胞体内,在Dicer酶的作用下生成siRNA。由于shRNA在结构上需存在一个反向的互补碱基序列,故在设计shRNA时,我们利用siRNA的碱基序列设计了一段它的互补结构,并用一个loop结构连接这两段RNA。根据我们利用分子克隆技术,在体外合成编码DAAO基因的shRNA核苷酸序列单链,退火形成shRNA双链之后,利用限制性内切酶技术将其克隆到真核表达载体pDC316-EGFP-U6中,委托第二军医大学的钱其军教授课题组包装为腺病毒。 第二,用腺病毒转染NRK-52E(大鼠肾小管上皮细胞)细胞,分别在24h和48h提取总RNA和蛋白质。RNA做RT反应获得cDNA,cDNA以GAPDH作为参照,进行Realtime PCR ,结果表明,实验组NRK-52E中的DAAO mRNA表达相对空白组和阴性对照组分别被抑制了51.7%和49.1%;DAAO蛋白以β-actin为参照,进行Western blot,DAAO蛋白表达相对空白组和阴性对照组分别被抑制了50.2% or 51.2%。确定了设计的该条有效的siRNA序列后,我们分别用腺病毒,PEI(Polyetherimide聚醚酰亚胺)为载体进行大鼠鞘内基因给药。连续给药7天后,我们通过皮下注射福尔马林溶液来建立慢性疼痛动物模型,测定大鼠福尔马林疼痛,并检测大鼠脊髓DAAO的沉默效果。结果显示:两种载体给药效果相当,大鼠福尔马林急性疼痛不受影响,而慢性疼痛抑制了约60%,用Real-time PCR和Western blot检测脊髓DAAO沉默效率约50%。 我们又选用了骨癌痛模型,用PEI载体鞘内给药,测试了沉默大鼠脊髓DAAO后的足底痛阈变化。鞘内基因给药对骨癌痛抑制了约40%。另外,我们监测了骨癌痛给药的时效曲线,发现给药5天后开始出现镇痛作用,在第7天达到最大镇痛药效,继续给药不能增强镇痛效果。给药10天后镇痛作用逐渐降低,停止给药后第8天镇痛作用消失。该结果将对siRNA的基因治疗提供临床依据。 沉默DAAO在骨癌痛实验中达到最大镇痛作用,即给药第10天时单次给药CBIO,非特异序列组(对照组)也出现40%的镇痛效果,而siRNA/ DAAO组(实验组)镇痛作用没有继续增强。结果说明CBIO对DAAO的抑制作用是特异性的,抑制脊髓DAAO对骨癌痛有40%的镇痛作用。 第四,由于前期研究发现星形胶质细胞在疼痛状态中处于激活状态,DAAO大量存在于星形胶质细胞。我们测试DAAO沉默后星形胶质细胞的变化,发现随着DAAO沉默后表达降低,星型胶质细胞的生物标记物GFAP(glial fibrillary acidic portein胶质纤维酸性蛋白)的表达也降低。说明星形胶质细胞的激活受到抑制。DAAO参与疼痛过程可能与星形胶质细胞的状态有关。 综上,我们用siRNA基因沉默的方法进一步证明了DAAO是慢性疼痛的潜在靶点,并推测DAAO参与疼痛过程可能与星形胶质细胞的状态有关。


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