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控制茄子果型相关性状关键基因的克隆及功能研究

韩洪强  
【摘要】:茄子(Solanum melongena)是亚洲及非洲等地区广泛种植的重要蔬菜作物,其种质资源丰富,具有丰富的果型多态性,是研究果实形状的理想材料。本研究以同源克隆技术为手段,在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和番茄(Solanum lycopersicum)的基础上,结合现有的基因组数据,从基因家族和单基因不同角度,克隆了茄子中控制果实形状的YABBY家族基因、SmOvate基因和Sm WOX13基因,并系统地进行了基因功能分析及其对茄子果型的影响,不仅可以完善果型控制相关理论,对茄果类作物育种也具有重要意义。1)由于茄子尚无基因组数据,从基因家族角度分析茄子非常困难。番茄和茄子都属于茄科茄属植物,研究亲缘关系较近且具有基因组信息的番茄YABBY基因家族可以为茄子中YABBY基因家族在果实形状控制上的研究提供重要依据。以YABBY结构域为种子序列扫描番茄基因组,找到9个家族成员。在24个已测序的物种中,除低等植物没有成员外,其它物种YABBY成员数目较稳定。番茄、拟南芥和水稻家族成员系统发生树表明,该基因家族具有5个分支,但在每个分支的数目上物种间有所不同。在2心室小番茄和多心室大番茄不同组织的基因表达分析中发现,仅SlYAB5b参与叶发育调控,而其它8个基因均参与调控花和果实的发育。其中,有的基因(SlD)具有正调控作用,而有的基因(SlFAS、SlYAB1和SlINO)则具有负调控作用。2)以番茄YABBY家族基因为参考序列同源克隆获得5个茄子YABBY基因分别是:SmYAB2、SmYAB3、SmFAS、SmCRC和SmYAB5。系统发生树分析表明,这5个茄子YABBY基因分布于YAB1/3、YAB2、CRC和YAB5四个分支,YAB2分支中包含SmFAS和SmYAB2两个基因。通过基因组序列克隆发现各个成员的基因结构与番茄中所对应基因相似,仅内含子大小具有差异。分别对各个基因在茄子叶、花和果实中进行表达量分析,发现该家族基因表达峰值与果实发育密切相关。五个茄子YABBY基因编码的蛋白都定位于细胞核,说明该家族基因可能行使转录因子功能。以病毒诱导基因沉默方式,对茄子YABBY家族单个成员分别进行基因沉默,结果表明SmFAS和SmYAB5在控制果实宽度上影响最大,其次为SmCRC,而SmYAB3和SmYAB2表型不明显。3)基于番茄ovate基因序列克隆了茄子SmOvate基因,并对基因的编码序列、内含子序列、外显子序列以及基因表达量在圆形和长形栽培茄子中进行了对比分析。在两类茄子1077 bp编码序列、467 bp内含子序列和1494 bp启动子区域中,没有找到与茄子果实形状直接相关的单核苷酸多态性位点或其它重要序列差异。但在对比圆形和长形茄子基因表达差异时发现,该基因在开花阶段已存在表达差异,并且于开花后第5天差异最为显著。以多物种的Ovate序列构建的系统发生树表明,SmOvate基因与拟南芥OFP7距离最近。亚细胞定位研究表明SmOvate蛋白位于细胞核。并且通过酵母双杂交试验发现,SmOvate与SmKnox存在互作关系,可能与拟南芥中形成Ovate-Knox蛋白复合体相类似,可进一步调控下游具有催化作用的GA20ox1基因表达以影响果实发育。4)WUSCHEL基因在植物发育中起着非常关键的作用,该基因家族编码的是具有WUSCHEL-related homeobox(WOX)结构域的转录因子。通过同源克隆方式获得茄子该基因cDNA全长为1233 bp,编码区为834 bp,具有3个外显子。包括番茄和拟南芥在内的WOX氨基酸序列构建的系统发生树表明,该基因编码的氨基酸序列与拟南芥WOX13和番茄WOX8关系较近。SmWOX13基因与GFP融合形成的蛋白被定位于细胞核,说明该蛋白可能是转录因子。本研究通过系统研究控制茄子果实形状的基因家族和单基因功能,明确了SmOvate、SmFAS和SmYAB5基因是控制茄子果型形状的关键基因,其中SmOvate基因与茄子长度相关,而SmFAS和SmYAB5主要控制茄子果实的心室数即粗度,同时也影响着果实的长度,这些结果对茄子果型育种具有重要的参考价值。


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