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蛋白激酶C在肿瘤再增殖中的作用及作用机制研究

程进  
【摘要】:肿瘤细胞再增殖被认为是肿瘤在放疗或化疗后发生复发的一个主要原因。为了搞清楚这一问题,本课题组在前期研究中发现在经放疗或化疗处理后,濒死的肿瘤细胞会释放强烈的促进生长的信号来刺激周围活肿瘤细胞的增殖。凋亡过程中重要的执行分子caspase 3与此刺激作用有关。被激活的caspase 3能够激活不依赖钙离子的磷脂酶A2(i PLA2),激活的i PLA2则进一步促进花生四烯酸的释放和前列腺素E2(PGE2)的产生。产生的PGE2是强烈的有丝分裂原,大量研究报道PGE2可最终刺激周围活肿瘤细胞的增殖。然而,除了i PLA2以外,我们推测caspase 3还可能激活其它蛋白分子而在肿瘤再增殖过程中发挥作用,比如蛋白激酶C(PKC)。PKC是一个至少包含11个亚型的大家族,不同的亚型具有不同的功能和作用。其中的某些亚型,比如PKCδ可被caspase 3切割并激活,且PKCδ具有促进细胞增殖的作用。因此,本课题旨在研究PKC在胰腺癌和结肠癌肿瘤再增殖过程中所起的作用以及分子机制。放射治疗后大量的肿瘤细胞发生凋亡,残存的少量肿瘤细胞可快速增殖,是肿瘤复发的主要原因之一。我们在体外建立并优化了胰腺癌和结肠癌的肿瘤再增殖模型。在这个模型中,我们将大量经过X射线照射的肿瘤细胞作为饲养细胞(Feeder),少量的荧光素酶标记的活肿瘤细胞作为报告细胞(Reporter),铺到大量濒死未标记肿瘤Feeder细胞上,并通过观察活肿瘤细胞的生长情况来判断肿瘤细胞发生再增殖的情况。我们发现,胰腺癌细胞Panc1和结肠癌细胞HT29在经过X射线照射处理后,凋亡细胞的比例明显增加,凋亡的Panc1和HT29细胞能显著刺激活肿瘤细胞的增殖。更重要的是,我们发现caspase 3,caspase 7和PKCδ在濒死胰腺癌和结肠癌肿瘤细胞刺激活肿瘤细胞增殖这个过程中都起极其重要地作用。经过X射线照射处理后Panc1细胞和HT29细胞中被切割的caspase 3,caspase7和pkcδ均显著增加。为了证实caspase3,caspase7和pkcδ在此过程中的重要性,我们构建了稳定表达caspase3,caspase7和pkcδ的显性负性突变体的肿瘤细胞,发现过表达突变体的肿瘤细胞在x射线照射处理后,其对活肿瘤细胞增殖的刺激能力都被显著减弱。我们还采用了pkc全酶抑制剂gf109203x以及pkcδ特异性抑制剂rottlerin来进一步证实了pkcδ在此过程中的重要性。另外,我们发现在过表达caspase3或caspase7突变体的panc1细胞中,pkcδ的切割和激活被显著减弱,提示pkcδ参与濒死肿瘤细胞刺激活肿瘤细胞再增殖的过程是受到caspase3和caspase7的调控。为了进一步揭示pkcδ作用的途径,我们利用westernblot检测了一系列信号传导分子的表达水平和磷酸化状态,发现经过x射线照射处理后的panc1和ht29细胞中akt,p38丝裂原激活蛋白激酶(p38mapk)以及c-jun氨基末端激酶/应激激活蛋白激酶(jnk/sapk或jnk1/2)磷酸化水平均显著性增加,因此被激活。抑制pkcδ的活性后,我们发现panc1细胞中akt和p38mapk的磷酸化激活被显著性抑制,但ht29细胞中只有akt的磷酸化激活被显著性抑制。这提示pkcδ在这两株肿瘤细胞中所调控的下游因子存在差异,其中akt可能起更重要的作用。在ht29细胞中,我们进一步利用pi3k/akt通路抑制剂ly294002预处理ht29细胞,发现抑制akt活性能显著性抑制凋亡的ht29细胞刺激活肿瘤细胞再增殖的能力。这一结果进一步证实了akt在此濒死细胞刺激活肿瘤细胞增殖过程中的重要性,并明确了caspase3/7-pkcδ-akt信号通路在结肠癌细胞ht29的肿瘤再增殖过程中起重要作用。为了寻找akt下游的生长因子,我们检测了经过x射线照射处理后panc1细胞中血管内皮生长因子(vegf)的表达水平,发现在x射线照射处理后vegf表达水平显著升高,并且当用pi3k/akt通路抑制剂ly294002预处理后,能显著地抑制vegf的表达上调。同时我们发现vegf的受体之一flk-1在panc1细胞中持续性高水平表达。我们提出caspase3/7-pkcδ-akt-vegf通路在胰腺癌细胞panc1的肿瘤再增殖过程中可能起重要作用。本研究揭示caspase 3/7-PKCδ-Akt-VEGF信号通路在肿瘤再增殖中起重要作用,为临床肿瘤治疗和新药开发提供了一个新的思路或靶点。


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