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抑制前列腺癌Notch通路增强多烯紫杉醇化疗敏感性的实验研究

崔迪  
【摘要】:目的:评估γ分泌酶抑制剂PF-03084014对去势抵抗性前列腺癌细胞Notch信号通路的抑制作用,观察癌细胞对多烯紫杉醇化疗的敏感性改变,并进一步探索PF-03084014提高多烯紫杉醇化疗敏感度的分子机制。方法:(1)体外实验:利用人前列腺癌细胞系DU145和PC3,多烯紫杉醇抵抗型DU145R和PC3R细胞,分别用DMSO、PF-03084014、多烯紫杉醇、多烯紫杉醇+PF-03084014孵育,测定细胞存活和NICD的表达。(2)体内实验:建立软组织和骨转移灶前列腺癌小鼠模型,当肿瘤体积达到基线后,随机分为四组,进行以下处理:对照、口服PF-03084014、注射多烯紫杉醇、PF-03084014+多烯紫杉醇联合治疗。每周两次评估肿瘤的生长情况。待处理周期结束后,获取肿瘤组织。免疫组化定量测定肿瘤组织中Ki67,cleaved-caspase 3和CD31的表达。PCR测定组织中HEY1和HEY2 mRNA的表达。Western blot方法来测定NICD,Cyclin E,BCL-2,BCL-xl,BAK,BAX,MEK1/2,phosphor-MEK1/2(ser217/221),ERK1/2,phosphor-ERK1/2(T202/Y204),AKT,phosphor-AKT(ser473),PI3K,phosphor-PI3K(tyr455/199),EGFR,P52,E-cadherin,Snail,Slug,MDR1,NANOG的表达。流式细胞计数测定组织细胞中ALDH的表达,无血清培养基下测定组织细胞悬浮成球能力。结果:(1)体外实验:PF-03084014抑制前列腺癌DU145,PC3和DU145R,PC3R细胞的生长和NICD的表达,并成浓度和时间依赖性。PF-03084014增强DU145R,PC3R对多烯紫杉醇的敏感度。(2)在多烯紫杉醇敏感型细胞皮下成瘤模型中,单独使用PF-03084014使DU145肿瘤的生长降低39.7%,PC3肿瘤降低28.9%;多烯紫杉醇处理组中,DU145肿瘤体积缩小36.1%,PC3缩小38.5%;而联合用药组DU145和PC3肿瘤体积分别降低了64.1%和56.6%。而四种不同处理组中小鼠体重并没有显著的差异(P=0.5786)。对于耐药型细胞皮下成瘤模型,单独使用PF-03084014使DU145R和PC3R分别下降45%和35%。而高浓度的多烯紫杉醇(10mg/kg)使DU145R和PC3R下降36%和18%。两种药物的联合治疗PC3R和DU145R肿瘤体积分别下降了74.4%和56.7%。对于耐药型细胞骨转移灶模型,多烯紫杉醇的处理并没有对肿瘤的生长产生抑制作用。而使用PF-03084014后,多烯紫杉醇的处理对耐药肿瘤重新产生抑制作用。免疫组化结果显示,相比于对照组,PF-03084014组中Ki67阳性率减少了19.8%,联合用药组减少了48%;PF-03084014组cleaved-caspase3的表达增加了1.9倍,联合用药组中升高了6.7倍。(3)在DU145皮下肿瘤中,PF-03084014组中Ki67表达相较于对照组下降了42.5%,cleaved-caspase3的表达上升了91%,微血管密度下降了84.4%;联合用药组,三种蛋白的表达的改变率为-68.3%,+290.6%,-88.4%。口服PF-03084014后,DU145和DU145R肿瘤组织中NICD-1蛋白的表达和Notch通路靶基因HEY1和HEY2 mRNA的表达均下降;细胞周期相关蛋白CyclinE的表达下降;促凋亡蛋白BAK和BAX表达升高,而抗凋亡蛋白BCL-XL和Bcl-2表达下降;DU145细胞中MEK-ERK通路磷酸化水平下降,DU145R细胞中AKTPI3K的磷酸化水平也被抑制;E-cadherin的表达上升,波形蛋白vimentin和EMT转录因子snail,slug的表达受到抑制;多重耐药相关蛋白MDR1的表达下降;表皮生长因子受体EGFR表达下降;NFkB家族蛋白P52的表达也下降。与对照组相比,喂养PF-03084014后,肿瘤组织中高表达ALDH的细胞比例降低,干细胞的转录因子NANOG的表达也降低。与多烯紫杉醇组相比,联合用药组中的DU145悬浮微球生成率下降,停药后肿瘤再生长的倍增时间降低。结论:在软组织和骨转移灶环境中,PF-03084014通过抑制Notch通路使CRPC细胞内促生长的信号减弱,促凋亡的信号增强,最终抑制去势抵抗性前列腺癌肿瘤的生长。同时它还通过抑制与耐药相关的多种途径,使多烯紫杉醇耐药型CRPC细胞再次对多烯紫杉敏感。这为联合PF-03084014和多烯紫杉醇的临床应用提供了必要的前期基础,为更有效的治疗CRPC提供了新的解决思路。


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