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碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌耐药机制研究

应春妹  
【摘要】:目的本研究通过了解我院鲍曼不动杆菌感染情况、耐药特征与流行趋势,研究重症监护病房临床菌株与环境菌株耐药特征,检测耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌水解酶及外排泵基因,检测主动外排系统结构基因与调控基因在亚胺培南耐药组(imipenem-resistant Acinetobacter baumannii IRAB)与敏感组(imipenem-sensitive Acinetobacter baumannii ISAB)中分布差异,对主要外排基因进行表达量分析,并研究外膜蛋白Omp34介导鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药,深入探讨鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物的耐药机制。方法1、本实验收集2012年7月到10月我院临床分离鲍曼不动杆菌共78株,并采用ERIC-PCR及PFGE技术对该78株临床分离株进行同源性分析,了解本院鲍曼不动杆菌是否存在克隆株的播散流行。2、同期采用琼脂稀释法检测神经外科重症监护病房(Intensive Care Unit,ICU)27株临床菌株和28株环境菌株对常用抗菌药物的最低抑菌浓度;用肠杆菌科基因间重复序列PCR(Enterbacteriat Repetitive Intergenic Consensus,ERIC-PCR)、多位点序列分型(Multi Locus Sequence Typing,MLST)及脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gelelectrophoresis,PFGE)技术对共分离的55株鲍曼不动杆菌进行基因分型,分析其可能的传播途径。3、采用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测78株临床菌株β-内酰胺酶基因(OXA-23、OXA-24、OXA-51、OXA-58、IMP-1、VIM-1、VIM-2、Amp-C)及RND家族3个主要外排系统Ade ABC、Ade IJK及Ade FGH结构基因(ade B、ade J、ade F、ade G、ade H)与调控基因(ade R、ade S、ade L)的携带情况,比较其在IRAB及ISAB中分布差异,进一步使用Realtime-PCR对其主要外排基因进行表达量分析,初步探讨鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物的耐药机制。4、研究通过采用双重同源重组技术在鲍曼不动杆菌ATCC 19606中构建Omp34基因的缺失突变株(ATCC 19606-△Omp34),采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)蛋白电泳分析外膜蛋白的表达,PCR法和基因测序进一步验证Omp34基因敲除。比较野生株和敲除株对常用抗菌药物尤其是碳青霉烯类的抑菌圈大小,以探讨外膜蛋白Omp34在介导鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药中的作用。结果1、临床分离78株鲍曼不动杆菌只对米诺环素耐药率稍低,为30.9%;其次为亚胺培南,耐药率为53.1%;对其它抗菌药物耐药率均超过60%;对头孢西丁、复方新诺明耐药率最高,分别为97.5%、93.8%。78株鲍曼不动杆菌ERIC-PCR结果显示可分为A、B、C、D、E、F 6型,A型62株,为主要克隆株,其中A型又分为A1型46株,A2型16株,B型7株,C型6株,D、E、F型各1株。PFGE主要分为7型,A型56株(包括A1、A2、A3三个亚型),B型7株,C型4株,D型5株,E型3株,F型2株、G型1株。2、临床分离27株鲍曼不动杆菌除对替加环素、粘菌素全部敏感,对其他14种抗菌药物普遍耐药,米诺环素耐药率稍低,为25.9%。其次为头孢哌酮/舒巴坦与亚胺培南,耐药率分别为51.9%、59.3%,对其他抗菌药物的耐药率均超过70%,对复方新诺明全部耐药。环境分离28株鲍曼不动杆菌相比临床分离菌株更为敏感,替加环素和粘菌素全部敏感,对美罗培南和头孢哌酮/舒巴坦的耐药率均为3.6%,对与亚胺培南耐药率为7.1%,对米诺环素、哌拉西林/他唑巴坦耐药率均为10.7%,对头孢西丁耐药率最高,为92.9%。27株临床分离鲍曼不动杆菌ERIC-PCR基因分型主要为A、B、C三型,其中A型20株,B型6株,C型1株。28株环境分离鲍曼不动杆菌主要可分为6型,A型13株,B型4株,C型2株,D型4株,E型2株,F型3株。27株临床分离鲍曼不动杆菌MLST分为5个ST型(ST 208,1-3-3-2-2-97-3;ST 368,1-3-3-2-2-140-3;ST 191,1-3-3-2-2-94-3;ST 195,1-3-3-2-2-96-3;ST 540,1-3-3-2-2-160-3)与4个新ST型。其中ST208是在神经外科ICU中分布最为广泛的基因型,占到了菌株数的66.7%,环境菌株中MLST主要有2个ST型(ST 208和ST229)。27株临床分离菌株PFGE可分为5型,其中A型23株(包括A1型15株,A2型7株,A3型1株),B型1株,D型2株,E型1株,28株ICU环境分离株主要分为9型,其中A型15株(包括A1型7株,A2型2株,A3型6株),B型2株,C型1株,D型2株,E型3株,F型2株,G、H、I型各1株。3、在78株鲍曼不动杆菌中,均检测到OXA-51,未检测到OXA-24、OXA-58、VIM-1、VIM-2基因。Amp C、OXA-23、IMP-1基因的检测率分别为84.6%、74.3%、56.4%。66株检测到Amp-C,其中42株为IRAB,22株ISAB。58株OXA-23阳性包括42株IRAB,12株ISAB。44株检测到IMP-1,其中23株为IRAB,19株为ISAB。加入外排泵抑制剂PAβN,78株鲍曼不动杆菌分离株中,41株(52.5%)对亚胺培南的MICs有了4~32倍的降低,可认为外排泵表型阳性。在Ade ABC外排系统中,ade B、ade S、ade R基因的检出率为77%、77%、73%。60株ade B阳性菌株中,39株为IRAB,19株为ISAB。在78株临床菌株中,检测到ade J基因72株(92%),其中42株为IRAB,28株为ISAB。ade L、ade F、ade G和ade H的检出率分别为94%、97%、90%和92%。70株ade G阳性菌株包括42株IRAB和26株ISAB。对8株IRAB和8株ISAB进一步使用实时荧光定量PCR对主要外排基因ade B、ade J和ade G进行表达量分析,经统计分析ade B和ade G在IRAB和ISAB中表达量差异具有统计学意义。4、通过PCR试验成功构建ATCC19606-△Omp34基因敲除株,并通过基因测序验证。SDS-PAGE蛋白电泳显示,敲除株较野生株在34k Da处有一个蛋白缺失,说明Omp34基因敲除成功。药物敏感性试验结果显示野生株和敲除株对碳青霉烯类抗生素的耐药性没有显著改变。结论我院神经外科ICU鲍曼不动杆菌对替加环素和粘菌素全部敏感,对米诺环素耐药率稍低,其次为头孢哌酮/舒巴坦和亚胺培南。临床可根据药敏结果选择合适抗菌药物。A型克隆株为我院鲍曼不动杆菌主要流行株,临床菌株与环境菌株具有较高同源性,且同时分布于其他多个科室,科室间存在交叉感染的可能性,需采取切实有效的措施及时进行干预。产生β-内酰胺酶Amp-C、OXA-23与主动外排系统Ade ABC、Ade FGH过表达在鲍曼不动杆菌碳青霉烯耐药中发挥重要作用。药物敏感性实验结果显示野生株和敲除株对碳青霉烯类抗生素的耐药性没有显著改变,提示Omp34外膜蛋白低表达仅仅是引起碳青霉烯类耐药的辅助因素。


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