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绿针假单胞菌高产吩嗪-1-甲酰胺的机制及合成过程强化研究

金雪洁  
【摘要】:绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66是本实验室从水稻根际分离得到的一株生防菌株,它可以分泌吩嗪类物质吩嗪-1-甲酰胺(Phenazine-1-carboxamide,PCN)。在吩嗪类物质合成途径中,PCN是吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid,PCA)通过一步酰胺基修饰后的产物。相较于已经开发为生物源农药的PCA(商品名为“申嗪霉素”),PCN在拮抗某些植物病原菌时显示出更好的效果,如防治引起番茄腐烂的尖孢镰刀菌等,而且PCN的稳定性更好,具有良好的应用前景。然而,绿针假单胞菌HT66的PCN产量较低,为425 mg/L。为了提高HT66菌株的PCN产量,本实验室前期研究从HT66野生菌株出发,经过多轮物理及化学诱变,获得了一株高产PCN的诱变菌株P3,其PCN产量是HT66的3.99倍。虽然对该高产菌株基因组测序发现其多个基因甚至蛋白发生了点突变,但是菌株细胞内所发生的生理生化、代谢及调控等方面的具体变化尚不清楚。本课题以绿针假单胞菌HT66野生型菌株和P3诱变菌株为研究对象,首先通过iTRAQ定量蛋白质组学技术从蛋白水平对P3菌株细胞内的代谢及调控变化进行分析讨论,初步揭示了P3菌株高产PCN的基本机制;然后,根据组学分析结果并结合文献报道,对P3菌株进行了系列基因工程改造,进一步提高了PCN产量。本课题的研究内容和发现主要包含以下五个方面:第一、通过基于Nano-LC-MS/MS的iTRAQ技术对HT66和P3菌株生长指数期后期的细胞全蛋白质组进行定性定量分析。结果表明,P3菌株中共有452个蛋白发生差异表达,其中上调蛋白181个,下调蛋白271个。将这些蛋白进行聚类分析及通路富集,结果显示,在PCN合成途径中,除了Phz C未检测到,Phz E有轻微下调外,其他参与PCN合成的蛋白均发生了显著的表达上调,这与P3菌株PCN的高产表型相一致。经过详细的分析讨论,推测许多参与氨基酸与能量代谢为主的初级代谢,以脂肽和几丁质酶为主的次级代谢,参与铁、磷和氮等无机营养物吸收和转化的代谢以及六型分泌系统(T6SS)等均与P3菌株高产PCN密切相关。当然,还有许多与细菌运动性、生物膜形成、趋化性以及信号转导等相关的蛋白也发生了差异表达,表明诱变育种对菌株生理生化、代谢调控等方面均产生了极大的影响。第二、通过系列实验基本证实了iTRAQ结果及我们对其结果的一些推测与假设。Lac Z融合实验证实了P3菌株中phz基因簇在翻译水平的表达强于HT66,这与iTRAQ结果相一致;对于在iTRAQ结果中有轻微表达下调的Phz E蛋白,发现phz E基因过表达可以较显著的提高PCN产量,表明Phz E蛋白在PCN合成中起比较关键的作用,很可能是PCN合成途径的关键酶;离子添加的发酵实验证实了对iTRAQ结果的推测,即降低发酵培养基中磷酸盐的浓度,在培养基中外源添加铁盐和无机氮源均有利于HT66或P3菌株PCN的合成;对T6SS的三个基因簇进行无痕敲除,结果表明,绿针假单胞菌中T6SS对PCN分泌或合成具有一定的抑制效果,编码T6SS系统的基因簇HS1、HS2和HS3在调控PCN合成过程中存在复杂的相互作用。第三、为了进一步提高绿针假单胞菌P3菌株的PCN产量,我们通过敲除pyk A和pyk F基因对PCN合成的初始前体PEP的转化途径进行了阻断,对以分支酸为共同底物的PCN竞争途径进行了改造。结果发现,阻断色氨酸合成途径及弱化苯丙氨酸途径均会显著影响菌株的生长。但阻断PEP的转化途径并不影响菌株生长,P3菌株PCN产量也有了较大幅提高,突变菌株P3Δpyk在发酵36小时的PCN产量为2589 mg/L,与P3菌株1750 mg/L的产量相比,提高了47.9%。第四、通过对phz基因簇Lac Z融合分析,结果表明phz基因簇的5’-UTR可能存在抑制序列;利用Mfold在线软件对phz基因簇5’-UTR转录的m RNA二级结构进行预测,发现+22nt至+78nt之间可形成发卡结构。将此发卡结构在P3Δpyk菌株中进行敲除,发现菌株的PCN产量从此前的2589 mg/L提高到了3219 mg/L,表明此结构确实抑制了PCN的合成。q RT-PCR的结果表明phz基因簇5’-UTR发卡结构通过调控PCN相关合成基因的表达来影响其产量。此外,将PCN合成途径的关键酶基因phz E整合进菌株基因组特异位点进行过表达,发现突变菌株P3ΔpykΔUTR||phz E的PCN产量又有13%的提高。第五、连续敲除ofa、hcn和fit次级代谢基因簇后,突变菌株P3AI的PCN产量最高达3673 mg/L,是P3菌株PCN产量的2.1倍。最后,根据本文研究结果,对KB培养基进行离子添加的改良,并利用此改良培养基对P3AI突变菌株进行发酵。结果发现,降低KB培养基K_2HPO_4的浓度、外源添加Fe Cl_3和NH_4Cl均会使菌株PCN产量有较大提高,但外源添加Fe Cl_3对PCN产量的提高幅度更大。P3AI菌株在含低浓度K_2HPO_4及外源添加Fe Cl_3和NH_4Cl的改良KB培养基中的PCN产量最高达到了5731 mg/L。q RT-PCR的结果表明,培养基中低浓度的K_2HPO_4及外源添加的Fe Cl_3均会通过影响PCN合成基因的表达来提高PCN的产量。综上,本文以绿针假单胞菌HT66和P3为研究对象,首先利用蛋白质组学分析方法揭示了P3菌株高产PCN的基本机制,并通过实验对其中一些假设进行了证实。然后利用系列基因工程方法对P3菌株进行了再改造,获得了高产PCN的突变菌株。最后通过发酵培养基的改良进一步提高了突变菌株PCN产量。此外,在课题开展过程中发现了绿针假单胞菌中一些对吩嗪类物质合成具有潜在调控作用的因子或基因位点。该研究不仅为PCN的工业化生产应用奠定了基础,也为此后绿针假单胞菌吩嗪类物质合成调控和生物技术应用提供了一定的理论和技术支持。


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