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cAMP拟似物及青藤碱衍生物治疗多发性骨髓瘤的机制研究

王莹莹  
【摘要】:第一部分环腺苷酸拟似物联合硼替佐米对骨髓瘤细胞生物学行为的影响尽管应用硼替佐米治疗多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)已成为标准一线方案,对硼替佐米耐药和缓解后复发仍是MM病人长期存活的主要障碍。体外研究发现,一些使细胞内环腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)浓度增高的药物可以诱导MM细胞增殖阻滞和凋亡。另一方面,MM动物模型研究提示,在体内c AMP通路调节剂对MM细胞同样具有诱导凋亡作用。然而,单一c AMP通路调节剂存在所需药物剂量较大而易导致毒副作用及安全性问题。为了进一步探究联合调变MM细胞多条信号通路的可能组合模式,我们以MM细胞株(包括硼替佐米敏感和耐药MM细胞株U266、H929、U266-BR和H929-BR细胞)以及从MM患者骨髓中分离得到的MM原代细胞为模型,观察这些细胞在c AMP拟似物8-对氯苯硫基环腺苷酸(8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3':5'-cyclic monophosphate,8-CPT-c AMP)与硼替佐米联合作用下的变化。结果显示:低剂量(4n M)硼替佐米与c AMP拟似物8-CPT-c AMP协同促进U266、H929、U266-BR和H929-BR细胞增殖阻滞和凋亡。进一步研究还发现联合应用硼替佐米与8-CPT-c AMP能明显抑制与骨髓基质细胞共培养U266细胞和MM原代细胞的生长并诱导其凋亡。此外,腺苷酸环化酶激动剂Forskolin明显增强低剂量硼替佐米对U266细胞生长抑制和诱导凋亡作用,提示间接升高细胞内c AMP水平药物同样可以协同硼替佐米诱导MM细胞凋亡。第二部分环腺苷酸拟似物联合硼替佐米诱导骨髓瘤细胞生物学行为变化的机制研究为了进一步明确8-CPT-c AMP协同硼替佐米诱导MM细胞生长受抑和凋亡的可能机制,我们采用RT-PCR、Western blot蛋白印迹、免疫共沉淀、蛋白酶体活性分析和小分子RNA干扰等技术,从细胞和分子水平探究二者相互协同模式和关键环节。结果显示:8-CPT-c AMP能够诱导MM细胞线粒体跨膜电位下降和内源性凋亡途径相关蛋白caspase9活化剪切,而低剂量硼替佐米能够显著增强该效应,提示8-CPT-c AMP和硼替佐米主要通过内源性线粒体途径介导MM细胞凋亡。另一方面,PKA选择性激动剂6-Bnz-c AMP能够显著抑制U266细胞增殖,而EPAC选择性激动剂8-p CPT-2′-O-Me-c AMP对U266细胞生长无显著影响;用基因敲除方法降低细胞内PKA水平能明显削弱8-CPT-c AMP和硼替佐米协同诱导MM细胞凋亡的作用,提示二者之间的协同作用可能与PKA途径密切相关。进一步研究发现,cyclin D1(细胞周期调控分子)不仅在硼替佐米耐药MM细胞内高表达,而且硼替佐米和骨髓基质细胞均可以诱导MM细胞内cyclin D1表达水平升高,此外在MM细胞内过表达cyclin D1可明显钝化8-CPT-c AMP和硼替佐米对MM细胞的凋亡诱导效应,提示cyclin D1可能是阻碍MM细胞凋亡主要障碍并与硼替佐米耐药密切相关。令人感兴趣的是,8-CPT-c AMP能够下调MM细胞内cyclin D1蛋白而使其退出增殖周期,而低剂量硼替佐米能够显著增强8-CPT-c AMP介导cyclin D1降解。此外,8-CPT-c AMP能够抑制去泛素化酶USP2表达,提示8-CPT-c AMP可能通过抑制去泛素化酶USP2而增加cyclin D1泛素化并促进其降解。研究还发现,8-CPT-c AMP可以抑制硼替佐米诱导的MM细胞自噬而干扰自噬途径,提示二药联合可能通过抑制自噬增加细胞内蛋白应激反应而促进MM细胞凋亡。第三部分青藤碱衍生物对骨髓瘤细胞生物学行为的影响及其机制研究传统中药青风藤的主要成分青藤碱作为一种异喹啉生物碱,具有抗炎和免疫调节等多种药理作用。为了拓展青藤碱临床应用,多个研究小组致力于青藤碱衍生物研发。前期研究显示,青藤碱衍生物YL064可以影响细胞IL-6表达而对细胞内JAK/STAT3通路具有调变作用,而该通路与MM发病密切相关。鉴于此,我们以MM细胞株U266、U266-BR和MM1.S细胞以及原代细胞为模型,观察YL064对MM细胞效应及其作用机制。结果发现:YL064可以诱导U266、MM1.S、U266-BR和MM原代细胞增殖阻滞和凋亡,同时对正常人外周血单个核细胞无明显细胞毒性,提示YL064能够相对选择性介导MM细胞凋亡。进一步研究显示,YL064能够抑制U266和MM原代细胞内STAT3活性,并对骨髓基质细胞和IL-6介导MM细胞内STAT3活化具有抑制作用,提示YL064可能通过抑制MM细胞内JAK/STAT3信号途径而进一步启动胞内凋亡相关通路。同时,STAT3荧光素酶报告基因转染实验和免疫荧光实验结果显示,YL064能够抑制STAT3对靶基因转录激活并干扰其细胞核内定位。此外,YL064能够下调STAT3调控基因cyclin D1和Mcl-1的表达,显示YL064对STAT3具有靶向抑制作用。进一步细胞热力学稳定性迁移分析实验和免疫荧光共定位检测显示,YL064可以与STAT3直接结合和细胞内共定位,提示YL064通过与STAT3直接相互作用而抑制其功能。总之,上述实验所揭示的青藤碱衍生物对MM细胞的诱导凋亡效应为构想MM新型治疗方案和药物靶标提供实验和理论基础。


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