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基于上转换纳米材料的新型光学超分辨技术

刘宇嘉  
【摘要】:光学显微系统具有三维、实时、无损的成像特点,是现代生物研究中的重要工具之一,但受衍射限制,光学显微系统的分辨率较低。近年来,一系列荧光超分辨显微技术成功打破了衍射极限,其中三位创始人被授予2014年诺贝尔化学奖。在超分辨技术中,受激辐射淬灭显微技术作为最早实现,且光学设计原理最直接的超分辨技术,以其三维、实时等成像特点,具有广泛的应用前景。然而对普通荧光染料,受激辐射淬灭显微技术实现淬灭过程的功率密度需求较高,对活细胞成像应用造成了障碍。稀土上转换材料是近年来新兴的一种无机荧光材料,具有激发态多、发光稳定、无闪烁、荧光寿命长且合成高度可控等一系列特点,被广泛应用于生物成像、探测等领域。其中以掺铒或铥作为激活离子的上转换纳米材料应用最为普遍。本论文将掺铥上转换纳米材料应用于超分辨技术,利用其高掺杂和长荧光寿命等特点,实现了低功率受激辐射淬灭超分辨和高容量荧光寿命解码定位。各章的主要内容如下:首先搭建了以钛蓝宝石振荡器作为淬灭光源的连续波长受激辐射淬灭超分辨系统,在荧光纳米小球上实现了约71 nm的超高分辨率,并对细胞骨架和RNA分子等精细生物结构进行了超分辨成像。结果表明,以钛蓝宝石振荡器作为连续波长淬灭激光源可以降低系统的复杂度和成本,但对有机染料进行超分辨成像时需要较高的淬灭功率密度,这对活细胞成像应用造成障碍。其次,将掺铥稀土上转换纳米材料应用于受激辐射淬灭显微系统,拟利用稀土元素长荧光寿命特点降低淬灭功率密度需求。根据稀土元素铥的多中间态特点,设计了中间态梯式淬灭机制。对不同激活离子掺杂浓度纳米颗粒样本的淬灭效率进行了系统测量,结果表明高掺样本可以大幅降低受激辐射淬灭的功率密度需求,而低掺样本与预期不同,不能有效实现淬灭。其中铥离子掺杂4%和8%的纳米材料样本的饱和强度同有机染料相比降低了两个数量级。系统在高掺纳米颗粒样本上成功实现低功率密度的超分辨成像。再次,深入研究高掺上转换材料降低淬灭光功率密度需求的机理,证实与低掺样本相比,高掺激活离子带来交叉弛豫速率提高,引起光子雪崩显著增强,促使处于中间态的激活离子数量迅速增加,从而实现对基态的粒子数反转,最终易于实现受激辐射淬灭。对照实验表明低掺交叉弛豫速率降低,难以发生光子雪崩。而后系统性的对时间、功率密度、材料合成等多重因素对掺铥上转换材料受激辐射淬灭过程的影响。最后,针对传统荧光编码容量受局限的问题,利用上转换纳米颗粒的荧光寿命高度可控特性,成功实现具有高容量的基于荧光寿命编码解码的新型定位解析技术,适用于共定位等位置信息分析的应用。通过实验论证了上转换荧光寿命库容量可超过上千种,并在五种纳米颗粒的混合样本上利用荧光寿命解码实现了对位置信息的解析分辨。


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