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天然产物来源的抗丙肝病毒药物的筛选

杨丽鸳  
【摘要】:丙型肝炎病毒(HCV)感染肝细胞后通常会引发慢性肝炎、肝硬化、甚至是肝癌,全球约有1.85亿人感染HCV病毒。在HCV复制过程中,NS3/4A丝氨酸蛋白酶负责多聚蛋白前体的切割,促使非结构蛋白成熟并发挥功能。因此,抑制NS3/4A蛋白酶活性,可以有效地抑制病毒前体蛋白的成熟和病毒复制,是抗HCV药物研发的重要靶点。近年来,针对NS3/4A蛋白酶的直接抗病毒药物(DAAs)开始应用于HCV感染的临床治疗,疗效显著,但也出现了较严重的耐药性和多种副作用,因此,筛选新型抗HCV药物具有重要的研究意义。本研究旨在利用NS3/4A蛋白酶抑制剂高通量筛选模型,从天然产物中筛选活性化合物,为抗丙肝药物的开发提供新型的先导化合物。主要研究内容如下:1)从HCV 1b型病毒的基因序列中选取了相似度高且具有代表性的病毒株HCV-1b/US/BID-V130/1994(GenBank:EU155330.2)作为研究对象。选取其中编码NS3/4A蛋白酶的基因序列,优化序列后进行全合成,进而构建该基因的大肠杆菌表达系统,获得具有较好生物活性的NS3/4A蛋白酶。利用FRET原理构建NS3/4A蛋白酶高通量筛选模型,并对筛选体系的pH,温度,酶量,底物量等指标进行优化。本筛选模型的建立,为后续从天然产物中高效筛选活性样品奠定了基础。2)对本实验室前期建立的土壤微生物发酵提取物库进行了筛选。经初筛、复筛及菌株复苏后获得7株活性菌株,本文对其中的4株活性菌株(SIPIFW-F4581,F4065,F4004,F4479)进行进一步的研究。经菌种鉴定F4581属土曲霉属(Aspergillus terreus),F4065属于斑点青霉属(Penicillium meleagrinum),F4004属于尖孢镰刀菌属(Fusarium oxysporum),F4479属于季也蒙毕赤酵母属(Meyerozyma guilliermondii)。利用活性追踪配合分离纯化的方法,从4株菌中共分离得到26个化合物。活性化合物4479-8和4479-10为一类新的萘啶酮类化合物,具有全新的1,3-二氢-1,7-萘啶酮结构骨架和一个独特的三氮环杂丙烷侧链基团。本研究首次报道了二噁英二酮类、麦角甾醇类、环二肽类以及新的萘啶酮类化合物的NS3/4A蛋白酶抑制活性,为HCV药物的开发提供了新的先导化合物骨架。3)对具有抗病毒活性的20种中药提取物样品进行活性筛选,综合考虑筛选数据和已报道的研究结果,本文重点针对研究较少的桑寄生和美登木进行活性化合物的分离鉴定。利用活性追踪配合分离纯化的方法,从桑寄生中获得活性化合物11个,其中9个化合物系首次从该植物中分离获得。从美登木中获得活性化合物8个,2个为首次从该植物中分离获得。生物活性评价结果显示黄酮类化合物、苯基庚烷类化合物、齐墩果烷型萜类、对称性酚类化合物为主要活性物质。本研究首次报道了苯基庚烷类化合物以及对称性酚类化合物的NS3/4A蛋白酶抑制活性,为HCV药物的开发提供了新的先导化合物骨架。综上所述,本研究以HCV 1b型NS3/4A蛋白酶为筛选靶标,构建其抑制剂的高通量筛选模型,对微生物及植物来源的天然产物进行以活性为导向的化合物分离鉴定,结果发现一类新的化合物骨架以及多种有望进一步研究的先导化合物骨架,为抗HCV药物的后续开发研究奠定了基础。


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