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大肠杆菌有氧条件下产1, 2-丙二醇及共利用甘油和葡萄糖产莽草酸的研究

邓静静  
【摘要】:由于能源危机和环境问题,生物柴油作为一种环境友好型的可再生能源迅速发展。在其生产中,甘油作为主要副产物大量积累,因此,把甘油转化成高附加值产物成为许多研究者的关注热点。本论文的研究内容即大肠杆菌利用甘油合成重要的有机化工原料——1,2-丙二醇和唯一有效治疗禽流感药物“达菲”的前体——莽草酸。(1)筛选能在有氧条件下将丙酮醇转化为1,2-丙二醇的大肠杆菌突变株大肠杆菌能以甘油为底物在厌氧条件下经丙酮醇合成1,2-丙二醇,但其代谢甘油的速率缓慢。本实验室前期构建了一株能高效利用甘油合成丙酮醇的大肠杆菌工程菌株,因此,若能在有氧条件下将丙酮醇转化为1,2-丙二醇,将大幅提高1,2-丙二醇的合成速率。本研究以不能在有氧条件下代谢甘油生长的菌株BW25113(35)glpK::kan为出发菌株,通过筛选得到一株可以在有氧条件下代谢甘油的突变菌株PDO1。静息细胞发酵实验表明菌株PDO1可以在有氧条件下将丙酮醇转化为1,2-丙二醇,且产量达到0.73 g/L,转化率达到0.493 g/g丙酮醇。然后我们对突变株有氧条件下代谢甘油及转化丙酮醇为1,2-丙二醇的机理进行了初步研究,为大肠杆菌有氧条件下代谢甘油合成1,2-丙二醇奠定了基础。(2)共利用甘油-葡萄糖混合碳源产莽草酸的大肠杆菌代谢工程研究有研究表明,大肠杆菌以甘油为唯一碳源时,通过磷酸戊糖途径的代谢流可能不足,这可能导致莽草酸的合成前体之一E4P的不足。因此,我们尝试在甘油培养基中添加少量葡萄糖,补充E4P的供给,从而增加莽草酸的产量。我们敲除了大肠杆菌BW25113野生型的基因ptsG,aroK和aroL,以及表达解除反馈抑制的基因aroG~(fbr),得到一株能共利用甘油-葡萄糖的产莽草酸菌株SA5。在甘油-葡萄糖培养基中培养结果表明,菌株SA5可以同时代谢甘油和葡萄糖,莽草酸产量达到0.40 g/L,比对照株提高110.5%,说明共利用甘油-葡萄糖可以有效提高莽草酸的产量。接着我们考察培养基中不同比例甘油-葡萄糖对莽草酸产量的影响。结果表明当甘油和葡萄糖之比为12:1(碳摩尔数)时,菌株SA5的莽草酸产量最高,达到0.46 g/L。然后我们检测菌株SA5在甘油-葡萄糖碳摩尔比例为12:1、6:1和纯甘油培养基中培养时胞内NADPH量,以及对基因ppsA、tktA、aroE、pntA、ackA和zwf进行qRT-PCR检测。结果表明菌株SA5在12:1和6:1甘油-葡萄糖培养基中培养时的NADPH量为甘油培养基中培养的的3.4倍,而与产物合成相关的基因的表达水平差别不大。因此,添加葡萄糖后能增加胞内的NADPH水平并最终导致了莽草酸产量的提高。为了进一步提高莽草酸的产量,我们在菌株SA5中同时过表达了基因ppsA和tktA,以及进一步敲除菌株中的乙酸激酶基因ackA。发酵实验表明过表达基因ppsA和tktA可以有效的提高莽草酸的产量;敲除基因ackA不能有效地减少发酵中期的乙酸产量,但是可以促进莽草酸产量的提高。本研究以新颖的想法,确立可行的实验方案,筛选出可以在有氧条件下转化丙酮醇为1,2-丙二醇的突变株,并构建共利用甘油-葡萄糖的大肠杆菌菌株,为有氧条件下代谢甘油合成1,2-丙二醇和以甘油为主要碳源高产莽草酸奠定了基础。另外,本研究对利用甘油合成其他高附加值产物也具有一定的参考意义。


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