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Pseudomonas protegens H78中(p)ppGpp全局性抑制初级代谢并激活次级代谢

吴玲玉  
【摘要】:Pseudomonas protegens H78是从油菜根际土壤分离得到的一株植物生物防治假单胞菌,可以产生多种次级代谢产物,如藤黄绿菌素(pyoluteorin,Plt)、2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinol,DAPG)、硝吡咯菌素(pyrrolnitrin,Prn)、环脂肽(orfamide)、铁载体pyoverdine和pyochelin等。(p)ppGpp是介导细菌细胞应答环境胁迫如营养饥饿等产生应激反应的重要胞内信号,本论文重点研究了(p)ppGpp介导的严谨应答反应对H78菌株基因组表达与细菌代谢的全局性调控机制。利用基因无痕敲除、RNA-seq、lacZ报告基因分析、表型测定等技术,系统分析了relA和spoT双基因突变体(即(p)ppGpp~0突变体)对H78基因组整体表达、抗生素与铁载体等次级代谢物的合成及基因表达、生长及营养元素利用等方面的全局性调控机制,结果表明,(p)ppGpp全局性抑制H78菌株的初级代谢,如DNA复制与细胞分裂、氨基酸代谢、碳代谢及能量代谢等,而全面激活抗生素、铁载体合成等次级代谢。首先,对在KMB培养基中处于对数生长后期的H78野生型和(p)ppGpp~0突变体进行RNA-seq转录组分析。结果分析得出结论,(p)ppGpp~0突变体中,转录本水平发生显著变化的一共有1463个基因(改变倍数2倍以上,且p0.05),大约占H78基因组的23%,其中767个基因的转录本水平发生下调,696个基因上调。主要的次级代谢基因簇,如plt、phl、prn、ofa、pvd、pch、fit等,均受到(p)ppGpp的正调控作用。而受(p)ppGpp抑制的基因簇主要涉及DNA复制与细胞分裂、氨基酸代谢、碳代谢、能量代谢、磷利用、鞭毛合成、Gsp-T2SS分泌系统等。接着,通过lacZ报告基因分析、抗生素及铁载体合成测定等技术,分析发现在(p)ppGpp~0菌株中,Plt、DAPG两种抗生素的合成均受到强烈抑制,铁载体合成也受到显著下调;Plt合成操纵子的表达几乎完全被抑制,Prn、Phl抗生素合成操纵子表达显著下调。结果表明:(p)ppGpp全局激活H78菌株抗生素、铁载体等次级代谢物的合成及基因表达。同时发现,H78菌株在KMB培养基中的生长受到(p)ppGpp的部分抑制。与P、Fe等营养元素利用相关的初级代谢基因簇也受到(p)ppGpp的显著调控,与磷利用相关的phoR/phoB、pst操纵子受到(p)ppGpp抑制,(p)ppGpp正调控与铁代谢相关的铁载体、hemophore、10对FecI/FecR家族调控子,而强烈抑制TonB_(4-6)转运系统。以基本培养基为对照,外源添加不同种类或浓度的磷、铁元素,测定菌株的OD_(600)来衡量菌株的生长状况。发现P浓度低时,(p)ppGpp增强菌株对P的利用率,P浓度高时,(p)ppGpp减弱菌株对P的利用率;(p)ppGpp增强Fe元素在菌体中的代谢速率。最后,另一个受(p)ppGpp调控的重要分类是分泌系统和运动性,包括H3-T6SS、Gsp-T2SS,鞭毛生物合成基因簇、Csu-T1菌毛、Pel和Psl等。综上所述,(p)ppGpp在H78菌株中全局性抑制初级代谢、激活次级代谢,并且调控H78的分泌系统和运动性等。(p)ppGpp对H78菌株在环境适应、生防作用等方面具有非常重要的意义。


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