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洛蒙德链霉菌S015中吩嗪类代谢产物的鉴定及高产工程菌的构建

张茁  
【摘要】:洛蒙德链霉菌S015(Streptomyces lomondensis S015)是本实验室从上海周边根际土壤中分离得到的具有抑菌活性的菌株。前期研究中,从该菌株的发酵产物中纯化鉴定到了吩嗪类抗生素——洛蒙真菌素(lomofungin)。本论文对菌株S015中的其它吩嗪类活性产物进行了分离纯化以及结构鉴定,并构建了高产吩嗪类化合物的基因工程菌。首先,对S.lomondensis S015的发酵液中的活性物质进行了分离纯化和结构鉴定。将S.lomondensis S015的发酵液经过等体积的2-丁酮萃取、C18制备型高效液相层析,最终从20 L发酵液中纯化得到18.9mg的产物A及23.4 mg的洛蒙真菌素。通过UPLC-MS确定产物A的分子量为300.22;结合~1H和~(13)C核磁共振波谱分析,确定该物质的化学结构为4,7,9-三羟基-6-醛基-吩嗪-1-羧酸(4,7,9-trihydoxyl-6-aldehyde-phenazine-1-carboxylic acid,THAPCA)。与洛蒙真菌素的结构相比,THAPCA在C-1位上的甲酯基变成了羧基。phoP是链霉菌中一个重要的调控基因,对放线紫红素(RED)和十一烷基灵菌红素(ACT)等次级代谢产物的合成起负调控作用。本论文通过对洛蒙德链霉菌S015中phoP的单基因敲除和回补,研究该基因对洛蒙德链霉菌S015中吩嗪类化合物生物合成的影响。phoP基因的缺失株S015ΔphoP不能合成洛蒙真菌素和THAPCA,在其发酵产物中也没有检测到其它吩嗪类化合物;而phoP基因的回补菌株S015ΔphoP::phoP可以合成吩嗪类化合物,表明phoP基因对控吩嗪类化合物的合成起正调控作用。最后,通过单基因过表达,研究了两个调控基因——phoP和adpA以及两个外源基因——metK和vHbS对洛蒙德链霉菌S015中吩嗪类化合物合成的影响。phoP、adpA、metK和vHbS基因的过表达菌株S015P、S015 A、S015 K和S015 S均对吩嗪类化合物的合成有促进作用。洛蒙真菌素的最高产量分别为136.4±11.3 mg/L、190.2±20.5 mg/L、187.8±15.1 mg/L和155.1±8.7 mg/L,达到了空质粒对照株S015 N0的2.2、3.1、3.0和2.5倍;THAPCA在培养8天时产量最高,分别为84.6±7.7 mg/L、63.3±6.8 mg/L、61.5±1.6 mg/L和60.3±5.3 mg/L,达到了空质粒对照株S015 N0的2.8、2.1、2.0和2.0倍。本论文发现了四个可以促进洛蒙德链霉菌S015中吩嗪类化合物合成的基因——phoP、adpA、metK和vHbS;本论文的研究对于提高链霉菌来源的吩嗪类化合物的产量、促进其商业应用也具有一定的价值。


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