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洛蒙德链霉菌S015中洛蒙真菌素生物合成基因的功能研究

盛超兰  
【摘要】:洛蒙德链霉菌S015(Streptomyces lomondensis S015)是本实验室分离自根际土壤的一株菌株,该菌株的发酵产物中有吩嗪类抗生素——洛蒙真菌素(lomofungin)。在前期研究中,通过对洛蒙德链霉菌S015进行全基因组测序及基因功能研究,确定了由lphzGFEDCB组成的吩嗪类化合物生物合成核心基因簇(NCBI:KP721214.1)及洛蒙真菌素C-7位的羟基转移基因——FAD依赖的单加氧酶基因lomoB。lomoB缺失突变株不能合成洛蒙真菌素,只能合成1-甲酯-6-甲酰-4,9-二羟基吩嗪(1-Carbomethoxy-6-formyl-4,9-dihydroxy-phenazine,CMFDP),与洛蒙真菌素相比,其C-7位缺少了一个羟基,由此证明了lomoB的羟基转移功能。为了进一步阐明洛蒙真菌素的合成途径,本文研究了氧化还原酶基因lomoF、酰基辅酶A脱氢酶基因lomoA和甲基转移酶lomoC对洛蒙真菌素合成的影响。对氧化还原酶基因lomoF进行无痕敲除得到基因缺失突变株,该菌株中洛蒙真菌素的产量仅为野生型S015的60%,同时在其发酵液中检测到了新产物compound A。该化合物在HPLC上的保留时间与从lomoB缺失突变株中分离纯化的吩嗪类化合物CMFDP相同;HPLC-MS分析发现其分子量为298.25,与CMFDP一致;进一步的HPLC-MS-MS显示其二级质谱图谱与CMFDP完全重合,由此推测lomoF基因缺失突变株发酵液中的新物质结构与CMFDP一致。分别在lomoF基因缺失突变株和野生型S015中过表达lomoF基因,发现lomoF基因回补株不能合成compound A,其洛蒙真菌素的产量恢复到野生型S015的水平;而lomoF基因过表达菌株中洛蒙真菌素的产量达到了野生型S015的1.5倍。推测本文研究的氧化还原酶基因lomoF对于洛蒙真菌素侧链C-7位羟基的转移具有促进作用。同样对酰基辅酶A脱氢酶基因lomoA和甲基转移酶基因lomoC进行无痕敲除,得到的基因缺失突变株均不能合成洛蒙真菌素,也未检测到其它吩嗪类产物。在基因缺失突变株中回补基因,得到的回补株都可以恢复洛蒙真菌素的合成。说明该酰基辅酶A脱氢酶基因lomoA和甲基转移酶基因lomoC在洛蒙真菌素生物合成中起着重要的作用,但这两个基因的具体功能还有待深入研究。本论文研究了洛蒙德链霉菌S015中,在洛蒙真菌素的生物合成核心基因簇附近的三个基因——氧化还原酶基因lomoF、酰基辅酶A脱氢酶基因lomoA和甲基转移酶基因lomoC对其合成的影响。推测lomoF基因可以促进洛蒙真菌素侧链C-7位羟基的转移,进而促进其合成;lomoA和lomoC基因对洛蒙真菌素的合成有显著影响。本论文的研究结果为阐明洛蒙真菌素的生物合成途径奠定了基础。


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