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胶样链霉菌中脂黄霉素的基因簇克隆表达及其生物合成研究

徐建国  
【摘要】:胶样链霉菌Sge12是从湖北省神农架原始森林分离的菌株,具有抗稻瘟病病原菌等抗真菌活性。围绕该菌株中抗真菌活性物质的挖掘及其生物合成,本研究进行了基因组测序与分析、抗真菌活性化合物分离纯化与结构鉴定、基因簇克隆与异源表达及其生物合成研究。首先,本论文对胶样链霉菌Sge12进行全基因组测序,anti SMASH预测分析发现基因组编码37个次级代谢基因簇。其中,并没有发现与已知抗真菌抗生素基因簇高度相似的基因簇,对活性化合物的鉴定及其基因簇的克隆形成挑战,但也暗示相应基因簇具有新颖性。同时,实验室前期构建了胶样链霉菌Sge12的基因组BAC文库,并用文库异源表达筛选技术获得7G7等三个具有抗真菌活性的BAC克隆。在此基础上,本论文通过末端测序和酶谱分析确定这些阳性BAC克隆之间共有69 kb重叠片段;将三个克隆转到变铅青链霉菌SBT18进行异源表达,其发酵产物具有相似的抗菌活性谱,暗示它们携带相同基因簇、可表达产生相同化合物。选取变铅青链霉菌SBT18/7G7进行大量固体发酵,根据活性追踪分离纯化化合物,化学结构解析表明活性化合物为脂黄霉素及其类似物NE-M2和NE-B1。随后,本研究通过大片段基因缺失和异源表达,将脂黄霉素基因簇定位在7G7中的21 kb片段上;再通过单基因敲除和异源表达,确定了脂黄霉素生物合成需要lxn A、lxn B、lxn C、lxn D、lxn E、lxn F、lxn G和lxn H等八个结构基因以及lxn R1和lxn R2两个正调控基因。进而通过LC-MS对各突变株进行代谢谱分析,发现lxn C缺失突变菌株积累了长链脂肪胺中间代谢产物。最后,根据基因敲除、生物信息学分析及突变株中间代谢产物的LC-MS分析结果,本研究推测了脂黄霉素的生物合成途径。综上,本研究克隆、定位并异源表达了脂黄霉素生物合成基因簇,并对其生物合成途径进行了分子遗传研究,为脂黄霉素高产菌株的构建及通过组合生物合成获得更多的抗真菌活性化合物的研究奠定基础。


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