收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

神经生长因子转染人脐带间充质干细胞治疗糖尿病神经源性膀胱的机制研究

武文博  
【摘要】:目的:糖尿病神经源性膀胱(Diabetic Neurogenic Bladder,DNB)是糖尿病患者常见的泌尿系统并发症。DNB的发病及进展具有时间依赖性,是在糖尿病病程的进展中逐渐累积加重的过程。现阶段尚无针对DNB的理想治疗手段,临床上只能通过对症处理缓解症状,并不能有效阻断DNB的进展及恢复已受损的膀胱功能。DNB的发病机制尚未完全清楚,国外文献报道:糖尿病大鼠模型L6-S1处脊髓背根及靶器官膀胱中神经生长因子(Neuron Growth Factor,NGF)的减少与DNB的发生发展密切相关。进一步实验证实通过补充外源性NGF可有效改善DNB症状并减缓疾病进展,提示补充NGF可能是治疗DNB的可行方案。因此,找到补充外源性NGF的合适方法及途径是研究的重点方向。人脐带间充质干细胞(Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,hUCMSCs)不仅具备多向分化的潜力同时又是良好的基因载体细胞。鉴于此,本课题在构建含人NGF的重组慢病毒载体并转染至hUCMSCs,并使hUCMSCs持续稳定表达NGF的基础上,将处理后的hUCMSCs移植到支配膀胱的L6-S1处脊髓背根,使外源性NGF和人脐带MSCs分别发挥基因治疗和细胞治疗作用,从而为DNB的治疗提供新思路。本论文研究主要有细胞实验及动物实验组成。在细胞实验部分,主要涉及脐带干细胞的提取、鉴定以及神经生长因子NGF的转染,为进一步的动物实验打下基础。在动物实验部分,本课题参照相关文献,选用SD雌鼠并利用链脲佐菌素(Streptozocin STZ)腹腔注射完成糖尿病模型的建立,并在建模成功3天后通过鞘内注射的方式向L6-S1脊髓背根处移植不同组hUCMSCs旨对疾病的进展进行早期干预。8周后通过尿动力观察各组大鼠排尿情况,并利用免疫组化、WB、免疫荧光的实验手段检测移植部位相关指标变化以及移植干细胞的存活分化情况,初步探究转染NGF基因的hUCMSCs改善DNB的作用机制。方法:1.hUCMSCs的分离与鉴定:从健康新生儿脐带中提取原代hUCMSCs;利用流式细胞仪对原代hUCMSCs细胞表面标记物进行鉴定;通过成骨成脂诱导分化实验,检测成骨成脂分化效果;验证hUCMSCs的多向分化能力;2.过表达NGF的慢病毒转染:筛选最佳MOI后使用慢病毒转染hUCMSCs;荧光显微镜拍照,估算转染效率;3.动物模型制备:通过一次性腹腔注射65mg/kg STZ制备SD大鼠糖尿病模型;观察记录大鼠空腹尾静脉血糖变化;4.转染NGF的hUCMSCs移植治疗及机制探究:分别通过鞘内注射转染NGF的hUCMSCs、hUCMSCs、慢病毒NGF-lentivirus以及PBS至大鼠L6-S1脊髓背根处;8周后检测其尿动力学参数改变情况,切片观察其膀胱组织改变;免疫组化Western Blot检测各组移植部位NGF、BDNF、NT-3等神经营养因子水平变化;免疫荧光共定位检测移植后NGF-MSCs的定位及分化情况。结果:1.原代hUCMSCs细胞形态呈长梭、漩涡状生长,hUCMSCs表达间充质表面抗原CD29、CD44,CD90,CD105,基本不表达白细胞标志抗原CD31、CD45,造血前细胞表面抗原CD34和HLA-DR。HLA-DR不表达证明hUCMSCs免疫原性低。分别诱导分化hUCMSCs具有成骨和成脂分化潜能,证实hUCMSCs具有多向分化能力;2.构建过表达NGF的慢病毒载体并成功转染至hUCMSCs,并能够稳定持续表达NGF;3.腹腔注射STZ 72小时后大鼠空腹尾静脉血糖升高均≥16.7mol/L,逐渐出现多饮、多食、多尿等典型糖尿病症状,体重明显减轻。8周后尿流动力学检测示最大膀胱容量增大,排尿点压力增加,残余尿增多,膀胱顺应性增高,逼尿肌收缩力弱;膀胱HE染色示膀胱逼尿肌纤维排列紊乱;4.通过鞘内注射移植后,在NGF-hUCMSCs与hUCMSCs组中大鼠DNB的尿流动力学参数较NGF-lentivirus组及PBS对照组有改善(P0.05),而NGF-hUCMSCs组要优于hUCMSCs组(P0.05)。HE染色示膀胱组织学示同样结果。注射部位L6-S1免疫组化染色、Western Blot示移植NGF-hUCMSCs及hUCMSCs后,其NGF、BDNF、NT-3阳性表达增加,而NGF表达水平在NGF-hUCMSCs组增高尤为显著(P0.01)。免疫荧光共定位提示移植后干细胞能够表达神经元特异性抗体Neu N及星型胶质细胞特异性抗原GFAP。结论:1.证实提取的新生儿hUCMSCs具有较高的增殖能力及多向分化能力,体外培养多代的hUCMSCs仍然具备干细胞的基本生物学特性且免疫原性低;2.成功构建携带过表达NGF的慢病毒载体;3.成功构建DNB大鼠模型;4.鞘内注射NGF-hUCMSCs、hUCMSCs能够缓解的进展、提高神经营养因子表达;5.移植后hUCMSCs能够分化为神经元及星型神经胶质细胞。本试验结果证明hUCMSCs移植不仅是一种潜在的细胞治疗手段,也是一种良好的基因治疗载体细胞,我们发现在疾病早期单纯的移植hUCMSCs后,能够一定程度上减缓疾病的进展,提示干细胞hUCMSCs移植具备潜在的治疗效果。而通过在早期移植转染NGF的hUCMSCs,不仅能够使hUCMSCs发挥细胞治疗作用,又能根据疾病特点针对性补充外源性NGF,充分发挥hUCMSCs的治疗潜力,达到细胞治疗及基因治疗的双重效果。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前16条
1 彭余江;李慧勇;何玺君;;神经生长因子转染的人脐带间充质干细胞促进中枢神经系统损伤修复的实验研究[J];浙江医学;2015年03期
2 赵雯红;程建新;史鹏飞;黄军岩;;转染IL-12基因的人脐带间充质干细胞对卵巢癌细胞的体外增殖和对裸鼠体内移植瘤的抑制作用[J];南方医科大学学报;2011年05期
3 施永彦;喻爱喜;张功礼;余永桂;邓长康;潘国栋;;腺病毒介导神经生长因子在绿色荧光蛋白基因标记的间充质干细胞中表达及意义[J];中华实验外科杂志;2006年05期
4 胡林萍;高瀛岱;郑国光;师迎旭;谢印良;刘拥军;袁卫平;程涛;;过氧化氢酶在人脐带间充质干细胞中作用的研究[J];中国实验血液学杂志;2010年02期
5 伞光;宋佳;;血小板衍生内皮细胞生长因子转染脂肪间充质干细胞促进移植脂肪血管化[J];中国组织工程研究;2015年41期
6 孙兆明;袁源;潘树茂;张菊华;王媛丽;汤国太;关茂武;陈鸿光;;脑源性神经营养因子真核表达载体转染人脐带间充质干细胞[J];中国组织工程研究;2012年45期
7 路君;赵红州;陈津;付云峰;黄梁浒;谭建明;;新型化学转染试剂对人脐带间充质干细胞的转染优化[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年49期
8 刘毅;薛美思;;携带人胰岛素基因慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞的实验研究[J];中国修复重建外科杂志;2010年07期
9 袁林;曹依娜;杨征毅;孙晋;潘广嗣;钱钧;宋晶晶;王涵;;人颌骨间充质干细胞的外泌体在巨噬细胞调控中的作用[J];实用口腔医学杂志;2017年03期
10 马妍;向阳;;间充质干细胞与基因治疗[J];中国医刊;2006年12期
11 王钰;朱志图;陈峻江;;血管内皮生长因子165基因促进人脂肪间充质干细胞的增殖[J];中国组织工程研究;2015年28期
12 刘美辰;刘霞;肖苒;曹谊林;;脂肪间充质干细胞治疗皮肤老化的研究进展[J];组织工程与重建外科杂志;2014年04期
13 王小莉;胡培;刘志祥;袁雅红;李东升;;体外合成EGFP的mRNA转染人脐带间充质干细胞的稳定性研究[J];细胞与分子免疫学杂志;2013年10期
14 姜玉玲;乔虹;刘梦雪;李强;孙玉倩;张巾超;;瘦素诱导体外培养大鼠脂肪间充质干细胞凋亡[J];生物工程学报;2008年07期
15 曹聪;外周血来源间充质干细胞研究进展[J];上海第二医科大学学报;2003年03期
16 朱慧;朱文侠;黄广智;马小娜;;携载增强型绿色荧光蛋白基因慢病毒标记小鼠脐带间充质干细胞示踪方法[J];延安大学学报(医学科学版);2019年03期
中国重要会议论文全文数据库 前20条
1 薛美思;刘毅;;携带人胰岛素基因慢病毒载体转染脐带间充质干细胞的实验研究[A];中华医学会整形外科学分会第十一次全国会议、中国人民解放军整形外科学专业委员会学术交流会、中国中西医结合学会医学美容专业委员会全国会议论文集[C];2011年
2 李坦;刘卓;徐运;;人脐带间充质干细胞治疗脊髓小脑共济失调3型的研究[A];中华医学会第十八次全国神经病学学术会议论文汇编(上)[C];2015年
3 闫国和;粟永萍;王军平;艾国平;王锋超;郑怀恩;程天民;;重组真核表达载体pEGFP-N1/PDGF-A的构建及真皮干细胞的转染[A];第六届全国生物医学体视学学术会议暨第九届全军军事病理学学术会议、第五届全军定量病理学学术会议论文汇编[C];2005年
4 门乙;;Gli1+间充质干细胞是治疗肿瘤术后颌骨缺损的潜在途径[A];2020年全国口腔颌面-头颈肿瘤学术大会暨中华口腔医学会口腔颌面-头颈肿瘤专业委员会学术年会——创新超越、共赢未来论文汇编[C];2020年
5 张卫东;郅克谦;;自噬基因LC3B促进颌骨间充质干细胞成骨分化影响颌骨骨质疏松的实验研究[A];2019第一届全国口腔颌面-头颈肿瘤学术大会——聚合引领、协同发展论文汇编[C];2019年
6 王佃亮;;用于批量制备的间充质干细胞过滤分离器的研制[A];中国生物工程学会第六次全国会员代表大会暨第九届学术年会论文集[C];2015年
7 潘兴华;庞荣清;阮光萍;蔡学敏;朱向情;何洁;赵晶;王强;王金祥;刘菊芬;沈丽蓉;杨建勇;朱光旭;李自安;吕燕波;石琳琳;马丽花;;人脐带间充质干细胞的产业化关键技术研究[A];中国生物工程学会2014年学术年会暨全国生物技术大会论文集[C];2014年
8 李琦;俞梦飞;王慧明;;LATS1依赖的材料性征对脂肪间充质干细胞分化的调控作用[A];2020年中华口腔医学会口腔生物医学专业委员会第十次全国口腔生物医学学术年会暨第六次全国口腔杰青优青论坛论文汇编[C];2020年
9 姜治伟;任凌飞;杨国利;;光控无血清硬腭粘膜间充质干细胞微球的制备[A];2020年中华口腔医学会口腔生物医学专业委员会第十次全国口腔生物医学学术年会暨第六次全国口腔杰青优青论坛论文汇编[C];2020年
10 陈硕;Yang Chai;;基于单细胞RNA测序Gli1+牙髓间充质细胞异质性研究[A];2020年中华口腔医学会口腔生物医学专业委员会第十次全国口腔生物医学学术年会暨第六次全国口腔杰青优青论坛论文汇编[C];2020年
11 陈硕;Yang Chai;;Runx2+niche细胞通过IGF信号通路调控牙髓间充质干细胞微环境[A];2020年中华口腔医学会口腔生物医学专业委员会第十次全国口腔生物医学学术年会暨第六次全国口腔杰青优青论坛论文汇编[C];2020年
12 李函文;吴永杳;袁泉;邵彬;;γ-氨基丁酸通过诱导TNFAIP3表达促进间充质干细胞成骨向分化的机制研究[A];2020年中华口腔医学会口腔生物医学专业委员会第十次全国口腔生物医学学术年会暨第六次全国口腔杰青优青论坛论文汇编[C];2020年
13 项蕾;施松涛;寇晓星;;钙环境调控间充质干细胞来源凋亡外囊泡的免疫调节效应[A];2020年中华口腔医学会口腔生物医学专业委员会第十次全国口腔生物医学学术年会暨第六次全国口腔杰青优青论坛论文汇编[C];2020年
14 崔晨;毕瑞野;刘蔚晴;李沛然;宋东哲;韦曦;周学东;樊怡;;Prx1~+间充质干细胞PTH1R在牙萌出中的调控作用研究[A];2020年中华口腔医学会口腔生物医学专业委员会第十次全国口腔生物医学学术年会暨第六次全国口腔杰青优青论坛论文汇编[C];2020年
15 黄智庆;马兰;寇晓星;施松涛;;人牙髓间充质干细胞的规范化鉴定[A];2020年中华口腔医学会口腔生物医学专业委员会第十次全国口腔生物医学学术年会暨第六次全国口腔杰青优青论坛论文汇编[C];2020年
16 吴迪;施松涛;寇晓星;;基于多元线性回归方法的间充质干细胞“生命”质量评价分析[A];2020年中华口腔医学会口腔生物医学专业委员会第十次全国口腔生物医学学术年会暨第六次全国口腔杰青优青论坛论文汇编[C];2020年
17 胡美林;党瑞;李琼;刘大勇;;核小体组装蛋白NAP1L2在间充质干细胞成骨分化过程中的作用研究[A];2020年中华口腔医学会口腔生物医学专业委员会第十次全国口腔生物医学学术年会暨第六次全国口腔杰青优青论坛论文汇编[C];2020年
18 李文磊;陈宏裕;陈宇奕;杨秋东;张卫兵;孙雯;;Prrx1+牙源性间充质干细胞的谱系示踪和功能作用[A];2020年中华口腔医学会口腔生物医学专业委员会第十次全国口腔生物医学学术年会暨第六次全国口腔杰青优青论坛论文汇编[C];2020年
19 刘瑾;高勃;;细胞外囊泡在骨髓间充质干细胞治疗皮肤创伤中的作用研究[A];2020中华口腔医学会口腔修复学专业委员会第十四次全国口腔修复学学术会议论文摘要汇编[C];2020年
20 张欣洲;;间充质干细胞研究进展[A];2014年国家级继续教育学习班暨贵州省中西医结合学会肾病专业委员会学术年会论文汇编[C];2014年
中国博士学位论文全文数据库 前20条
1 张宇;脂肪间充质干细胞对大鼠肝移植术后免疫抑制及其机制的研究[D];华中科技大学;2014年
2 周方宇;共培养兔髓核细胞诱导大鼠脂肪间充质干细胞分化的研究[D];华中科技大学;2010年
3 李成林;人诱导多能干细胞来源的间充质干细胞调控小鼠免疫反应的机制研究[D];厦门大学;2015年
4 龚年金;基于温法理论探讨温肺化纤汤预处理对H_2O_2诱导小鼠肺间充质干细胞氧化损伤保护作用机制研究[D];江西中医药大学;2019年
5 邵联波;低免疫排斥性的间充质干细胞及其外泌体在心肌梗死修复中的机制研究[D];苏州大学;2018年
6 张明琦;眼眶周脂肪来源间充质干细胞对视网膜祖细胞增殖和分化的影响机制研究[D];中国医科大学;2019年
7 杜文敬;绵羊脐带间充质干细胞iPSCs诱导及定向分化的研究[D];东北林业大学;2019年
8 芦笛;间充质干细胞在急性移植物抗宿主病和异体皮片移植排斥反应中对B细胞的免疫调节作用研究[D];中国人民解放军医学院;2019年
9 毛萌;盆腔器官脱垂动物模型探索及人脐带间充质干细胞重建盆腔器官脱垂薄弱阴道壁的研究[D];北京协和医学院;2019年
10 杨楠;PD-L1基因修饰增强间充质干细胞对T淋巴细胞的免疫抑制作用及其调控机制[D];中国人民解放军医学院;2019年
11 彭定伟;脐带间充质干细胞治疗颅脑创伤的疗效与机制研究[D];天津医科大学;2019年
12 孟宪会;基于miRNA的间充质干细胞干性维持机制及应用研究[D];东南大学;2018年
13 蒋梦会;磷酸酶SHP1调控间充质干细胞的分化机理研究[D];上海交通大学;2016年
14 赵永佳;经血间充质干细胞对阿尔茨海默病模型小鼠的作用及机制研究[D];浙江大学;2019年
15 陈朱越;人脐带间充质干细胞条件培养基改善放射性心肌纤维化的实验研究[D];华中科技大学;2019年
16 农卡特;人诱导多能干细胞来源的间充质干细胞在肝脏疾病上的应用研究[D];上海交通大学;2016年
17 何骁;间充质干细胞免疫调节功能可塑性及其在类风湿关节炎中的转化研究[D];中国人民解放军陆军军医大学;2019年
18 邵加华;Kartogenin预处理对髌下脂肪垫间充质干细胞外泌体修复关节软骨的作用及机制探索[D];中国人民解放军海军军医大学;2019年
19 谢晓琳;炎症微环境对间充质干细胞衰老的影响及机制研究[D];武汉大学;2019年
20 刘忠山;脐带间充质干细胞修复放射性皮肤溃疡机制的蛋白质组学研究[D];苏州大学;2018年
中国硕士学位论文全文数据库 前20条
1 武文博;神经生长因子转染人脐带间充质干细胞治疗糖尿病神经源性膀胱的机制研究[D];上海交通大学;2017年
2 王琳;携带白介素-18基因的人脐带间充质干细胞的构建及其意义[D];青岛大学;2014年
3 张辉挺;异种移植人脐带间充质干细胞在大鼠肝切除模型发生病理学反应[D];暨南大学;2013年
4 冯幸子;大鼠诱导分化脂肪间充质干细胞对自体免疫性肝炎治疗机制研究[D];昆明医科大学;2013年
5 徐志刚;脂肪间充质干细胞与自体髓核细胞共培养中相互作用分子机制初步研究[D];华中科技大学;2010年
6 钟艳;肝损伤大鼠血清对脐带间充质干细胞的影响[D];中南大学;2014年
7 陈俊秋;间充质干细胞外泌体促进低氧条件下胰岛细胞存活和血管生成[D];厦门大学;2019年
8 李阔阔;无支架间充质干细胞TEC修复猪膝关节软骨缺损的实验研究[D];深圳大学;2019年
9 陈欢欢;DKK1促进间充质干细胞迁移的机制研究[D];苏州大学;2018年
10 李晓利;人脐带间充质干细胞外泌体对环磷酰胺诱导的颗粒细胞凋亡的实验研究[D];新乡医学院;2020年
11 袁挺;人嗅黏膜间充质干细胞向血管内皮细胞定向分化的研究[D];湖南师范大学;2017年
12 刘书婷;MiR-26b靶向ROCK1调控间充质干细胞迁移的机制研究[D];苏州大学;2018年
13 朱茄慧;Wnt11促进BMP9诱导间充质干细胞骨向分化与TGF-β1的关系研究[D];重庆医科大学;2019年
14 李康;黄芪甲苷对氧化应激诱导的脐带间充质干细胞凋亡作用的影响[D];河北医科大学;2019年
15 毕冉冉;人诱导型多能干细胞来源的间充质干细胞功能表征、稳定基因标记及针对缺血环境的体外调控研究[D];锦州医科大学;2019年
16 夏海兵;脂肪间充质干细胞外泌体缓解阿霉素所致急性心肌损伤的研究[D];蚌埠医学院;2019年
17 王成;脐带间充质干细胞治疗中晚期特发性肺间质纤维化的机理及机制探究[D];山东中医药大学;2018年
18 孙石磊;骨碎补与3D打印的新型骨组织材料修复糖尿病性牙槽骨缺损及其机制[D];哈尔滨商业大学;2019年
19 徐进;间充质干细胞疗法治疗糖尿病足溃疡的Meta分析[D];南昌大学;2019年
20 成亚琳;FSHβ增强BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的作用与机制研究[D];重庆医科大学;2019年
中国重要报纸全文数据库 前20条
1 赵鲁;前途光明的间充质干细胞[N];中国科学报;2014年
2 赵鲁;用脐带间充质干细胞治疗重症新冠病毒肺炎项目立项[N];中国科学报;2020年
3 王伟强;科学家发现功能活性更强的间充质干细胞[N];中国科学报;2017年
4 邹争春 记者 陆成宽;我科学家培育出“三抗一修”间充质干细胞[N];科技日报;2020年
5 特约记者 邹争春;新型“三抗一修”间充质干细胞问世[N];健康报;2020年
6 见习记者 卜叶;科学家勾勒间充质干细胞临床应用“路线图”[N];中国科学报;2019年
7 赵广立;胎盘间充质干细胞治疗糖足获新进展[N];中国科学报;2018年
8 本报记者 刘艳芳;牙髓间充质干细胞填补了干细胞研究的空白[N];广东科技报;2017年
9 上海生科院 上海交大医学院健康科学研究所 曹楷;间充质干细胞:干细胞中的孙悟空[N];上海科技报;2014年
10 第三军医大学西南医院输血科 李忠俊 整理 吴刘佳;间充质干细胞研究又见新方法[N];健康报;2013年
11 刘道安;细胞产品国家工程研究中心启用间充质干细胞库[N];健康报;2007年
12 记者 陈建强;首家间充质干细胞库在津建成[N];光明日报;2006年
13 南方日报记者 严慧芳;选择干细胞储存须谨慎[N];南方日报;2016年
14 冯国梧;全球首个脐带间充质干细胞库规模化运营[N];科技日报;2008年
15 刘莹清;全球首个脐带间充质干细胞库泰达规模运营[N];北方经济时报;2008年
16 林华;首个脐带间充质干细胞库规模化运营[N];中国知识产权报;2008年
17 王伟强;标准推动干细胞产业化发展[N];中国科学报;2017年
18 记者 李素锋;我市首例间充质干细胞移植手术取得成功[N];临汾日报;2009年
19 姜明;全球首个脐带间充质干细胞库实现规模运营[N];工人日报;2008年
20 陈伟;间充质干细胞——未来医学新希望[N];光明日报;2014年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978