GPR40激动剂GW9508和阿片类镇痛药地佐辛镇痛作用及其机制研究

【摘要】：第一部分【背景】G蛋白偶联受体40(G-protein-coupled receptor 40,GPR40),又称自由脂肪酸受体1,在诸如脊髓的各种组织中广泛表达,激活后可发挥多种生理功能,包括疼痛调节。本研究旨在阐明神经病理性疼痛中,GPR40激活诱导的镇痛机制,特别是与脊髓神经胶质细胞表达的IL-10和随后的β-内啡肽的关系。【方法】本研究采用L5/L6脊髓神经结扎的神经病理性疼痛模型,验证了了GPR40激动剂GW9508在神经病理性疼痛中的镇痛作用。在脊髓和培养的原代小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元中检测了β-内啡肽和IL-10水平;同时在在脊髓和培养的原代小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元中通过双重或三重免疫荧光检测了β-内啡肽和IL-10的表达。并进一步在体内外通过疼痛行为学检测、PCR和ELISA等技术探索了GPR40的镇痛机制。【结果】GPR40在脊髓的小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元上均有表达,并且可由脊神经结扎引起的神经损伤上调。鞘内注射GPR40激动剂GW9508可剂量依赖性地缓解神经病理性疼痛大鼠的异常机械性疼痛反应和热痛觉过敏,E_(max)值分别为80%MPE和100%MPE,ED_(50)值分别为6.7和5.4μg。GW9508的镇痛作用可被选择性GPR40拮抗剂GW1100阻断,但不被GPR120选择性拮抗剂AH7614所影响。鞘内注射GW9508可显著增强脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞中的IL-10和β-内啡肽免疫荧光染色强度,但不增强神经元中IL-10和β-内啡肽免疫荧光染色强度。GW9508刺激培养的1日龄新生大鼠脊髓来源的原代细胞后,亦可以显著升高小胶质细胞和星形胶质中的IL-10和β-内啡肽的基因和蛋白质的表达,但不能刺激神经元中二者的表达增加。在培养的原代小胶质细胞中,IL-10抗体预处理后,能抑制GW9508刺激引起的β-内啡肽前体基因(proopiomelanocortin,POMC)高表达,但不影响IL-10的基因高表达,而β-内啡肽抗体既不影响GW9508刺激引起的IL-10基因高表达,也不影响POMC基因的高表达。GW9508处理原代小胶质细胞后,可增加细胞中丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)的磷酸化水平,包括p38、细胞外信号调节激酶(ERK)和c-Jun N末端激酶(JNK),并且其对IL-10和POMC表达的刺激作用可被每个MAPKs亚型选择性抑制剂所阻断。鞘内给予GW9508产生的镇痛作用可被鞘内注射米诺环素、IL-10中和性抗体、β-内啡肽抗血清和μ-阿片受体偏向性拮抗剂纳洛酮完全阻断。【结论】我们的研究结果表明,GPR40激活后通过脊髓神经胶质细胞的IL-10/β-内啡肽途径发挥镇痛作用。第二部分【背景】地佐辛是一种在中国广泛使用的阿片类镇痛药,在临床使用量远超国际止痛金标准的吗啡,其镇痛效力高,镇痛活性广,耐受性较低。本实验室之前的研究发现,在L5/L6脊神经结扎引起的神经病理性疼痛大鼠模型中,地佐辛的镇痛由μ-阿片受体(μ-opioid receptor,MOR)激动和去甲肾上腺素重摄取抑制(norepinephrine reuptake inhibition,NRI)所介导。他喷他多同样有着μ-阿片受体激动和去甲肾上腺素重摄取抑制的双重作用,是公认的首个上市的MOR-NRI双靶点类镇痛药。在本研究中,我们将地佐辛和他喷他多在骨癌疼痛中的镇痛作用及其机制做了对比研究。【方法】本研究主要采用胫骨内注射接种乳腺癌细胞Walker 256引起的骨癌疼痛大鼠模型,通过地佐辛或他喷他多及干预药物的给予检测疼痛行为学的变化,进一步探索地佐辛和他喷他多在骨癌疼痛中的镇痛机制。【结果】在胫骨内注射接种乳腺癌细胞Walker 256引起的骨癌疼痛大鼠模型中,皮下注射地佐辛和他喷他多均能剂量依赖和时间依赖地发挥抗机械性疼痛的作用,Emax值分别为68%MPE和75%MPE,ED50值分别为0.2mg/kg和5.1 mg/kg。他们的这种抗机械性疼痛的作用均可被鞘内注射μ-阿片受体选择性拮抗剂CTAP和非选择性α-肾上腺素受体拮抗剂酚妥拉明或选择性α2-肾上腺素受体拮抗剂育亨宾部分阻断。当鞘内给予去甲肾上腺素选择性耗竭剂6-OHDA耗竭脊髓组织中去甲肾上腺素时,也可以部分阻断皮下注射地佐辛和他喷他多所产生的镇痛作用。此外,μ-阿片受体选择性拮抗剂CTAP与选择性α2-肾上腺素受体拮抗剂育亨宾联用时可完全阻断地佐辛和他喷他多的镇痛作用。而κ-阿片受体选择性拮抗剂GNTI和nor-BNI、δ-阿片受体选择性拮抗剂naltrindole或5-羟色胺选择性耗竭剂PCPA均不影响地佐辛和他喷他多的镇痛作用。因此,我们的研究工作表明,在骨癌疼痛中,地佐辛和他喷他多均能发挥显著的镇痛作用,均通过脊髓μ-阿片受体激动和去甲肾上腺素重摄取抑制产生镇痛作用,而不通过脊髓κ-阿片受体和δ-阿片受体活化、5-羟色胺重摄取抑制或其他机制。【结论】我们的研究进一步证明了地佐辛和他喷他多一样,是MOR-NRI类药物,且在骨癌疼痛中有着较为显著的镇痛作用,为扩大地佐辛的临床应用镇痛谱提供了理论依据。