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百子莲Y_2SK_2与SK_3脱水素逆境保护生理功能研究

杨舟  
【摘要】:脱水素与植物对水分胁迫的响应紧密相关。前期研究发现,百子莲(Agapanthus praecox)脱水素ApY_2SK_2与ApSK_3在百子莲胚性愈伤的超低温保存过程中积极响应复合逆境,并获得二者的全长cDNA和编码蛋白序列。本文通过体内与体外实验进一步揭示百子莲脱水素ApY_2SK_2与ApSK_3的逆境保护功能。对野生型和ApY_2SK_2,ApSK_3过表达拟南芥不同胁迫处理后的形态指标的观测结果表明,转基因拟南芥植株的抗逆性相对于野生型明显提升,其在逆境下的单株鲜重、莲座大小和根长均能高于野生型。生理指标检测结果显示,相对于野生型,ApY_2SK_2与ApSK_3过表达植株在盐、渗透、低温和干旱胁迫下,表现出膜脂过氧化程度和ROS水平的降低,抗氧化活性、脯氨酸含量和光合能力的提升。ApY_2SK_2与ApSK_3同时能够提升大肠杆菌在各种胁迫下的存活率,并且ApY_2SK_2能更有效的提升植物和原核细胞的抗逆能力。亚细胞定位结果表明,ApY_2SK_2与ApSK_3均能定位于细胞质和细胞膜,ApY_2SK_2同时可定位于细胞核。采用pET21a载体与Transetta(DE3)大肠杆菌进行蛋白原核表达,ApY_2SK_2-His最佳诱导条件为1.0~1.5 mM IPTG,35°C下诱导5~6 h;ApSK_3-His最佳诱导条件为0.2~0.5 mM IPTG,25°C下诱导5~6 h。蛋白纯化方式的简化实验表明,可采用菌液煮沸裂解的方式快速纯化富集无His标签的ApY_2SK_2和ApSK_3蛋白以应用于体外实验,并验证了脱水素蛋白的热稳定性。体外实验结果表明,ApY_2SK_2和ApSK_3在冻融过程中均能有效保护LDH酶活性,ApY_2SK_2同时能够在脱水过程中保护酶活性;体外ROS清除实验表明ApY_2SK_2和ApSK_3均能显著抑制Fenton反应中羟自由基的产生;IMAC实验表明ApY_2SK_2和ApSK_3脱水素蛋白能够结合金属离子,亲和力顺序为Co~(2+)Ni~(2+)Cu~(2+)Fe~(3+),且ApSK_3具有较强的金属离子结合和ROS清除功能。超低温实验表明,ApY_2SK_2和ApSK_3转基因拟南芥幼苗处理后的存活率为47%和55%,显著高于野生型幼苗的存活率23%;同时,在植物玻璃化溶液中添加纯化的ApY_2SK_2和ApSK_3蛋白后能够将野生型拟南芥的存活率提升至50%和46%。本研究证明,ApY_2SK_2和ApSK_3能有效地提高细胞对胁迫的耐受能力,并在体内与体外的多个方面具有应用潜力。


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