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代谢工程改造微生物生产1,3-丙二醇和2-苯乙醇的研究

刘洪玉  
【摘要】:醇,是脂肪烃、脂环烃或芳香烃侧链中的氢原子被羟基取代而形成的一大类有机化合物,分为脂肪醇、脂环醇和芳香醇。它们在食品、医疗、能源、化工和材料等领域都具有广泛的用途。随着不可再生化石资源的日益消耗和随之而来的环境问题,使得开发利用可再生资源进行绿色生产的模式受到越来越多的关注。近年来代谢工程和合成生物学研究发展迅猛,利用微生物转化廉价碳源(例如粗甘油、木质素和二氧化碳等)生产多种高值化合物受展现了巨大的前景。基于此,本论文以1,3-丙二醇和2-苯乙醇的微生物合成为主题,主要从以下几个方面展开了研究。首先,利用系统代谢工程的手段构建更高效的细胞工厂,以提高1,3-丙二醇的生物生产。产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)是一种革兰氏阴性杆菌,隶属于肠杆菌科。但是,目前利用Klebsiella oxytoca以甘油为底物发酵生产1,3-丙二醇的方法和工艺还存产物浓度低、底物利用效率低等问题。针对以上面临的问题,对一株Klebsiella oxytoca PDL-0进行了系统的代谢工程改造,成功的将甘油氧化途径中部分用于副产物合成的代谢流转到还原途径1,3-丙二醇的合成中,提高了甘油发酵的利用效率,简化后提取工艺,降低废弃物的产生及成本。将K.oxytoca PDL-0的乳酸、乙醇、丁二醇、琥珀酸和乙酸等副产物合成途径进行了逐一或组合失活,通过组合辅因子的再生及细胞呼吸效率的提高,最终1,3-丙二醇的产量可达到74.9 g L~(-1),与野生型菌株相比提高了107.5%;副产物的量降低了42.8%,并且细胞的生长速度明显提高。本章的工作通过对副产物合成途径进行优化组合改造、结合辅因子再生及细胞呼吸效率改善等,提高工程菌株的生产性能,所使用的代谢工程策略也可对其他生物炼制过程的改进提供借鉴和指导。其次,提出了一种利用天然空间分隔来解决合成生物学中不适配问题的新策略。随着合成生物学的发展,蓝藻由于可以直接转化太阳能和二氧化碳合成所需的化合物进行光合生长,受到了越来越多的关注。然而,在代谢工程改造蓝藻进行光合生产的研究中,由于导入的异源途径和蓝藻宿主间的不适配性限制了目标化合物的光合生产,例如氧敏感、辅因子平衡及代谢产物耐受等。1,3-丙二醇是一种重要的平台化合物,在化妆品、食品、医药和新型聚合物(polytrimethylene terephthalate,PTT))合成等领域具有广泛的应用。然而,在1,3-丙二醇光合生产的研究中,途径中的关键酶(甘油脱水酶,GDHt)对氧敏感,氧敏感的不适配问题限制了1,3-丙二醇的光合生产。因此,我们选取1,3-丙二醇为目标化合物,利用Anabaena sp.PCC7120的自然细胞分化(异型胞)进行空间分隔,有望通过所提出的空间分隔的策略来解决1,3-丙二醇光合生产中不适配的问题(氧敏感)。分别构建了兼性厌氧菌(Klebsiella pneumoniae)和严格厌氧菌(Clostridium butyricum)基因来源的1,3-丙二醇光合生产模块,及其光合生产菌株。探索在有、无异型胞进行空间分隔的情况下工程菌株(P11、P12、P13和P14)1,3-丙二醇的合成特点。当异型胞存在时含模块KP的工程菌P11的1,3-丙二醇累积量为46mg L~(-1),比异形胞不存在时大约高出1.7倍。此外,含有模块CB的工程菌株(P12、P13和P14),仅在异型胞存在时检测到1,3-丙二醇累积。结果表明,利用Anabaena sp.PCC7120的自然细胞分化(异型胞)进行空间分隔,使1,3-丙二醇光合生产中氧敏感元器件在产氧生物中的功能性组装,实现了1,3-丙二醇的光驱动生产。Anabaena sp.PCC7120的特化细胞—异型胞对氧敏感的1,3-丙二醇生物合成模块具有重要的保护效果。这里所提出的利用天然空间分隔来解决光合生产中氧敏感所导致的不适配性问题的策略具有重要的意义和潜在的应用价值。第三,基于代谢途径和光合链可塑性的2-苯乙醇光驱动合成。由于光合效率和代谢刚性的限制,在利用蓝藻进行光合生产时,大多数目标化合物都局限于以靠近碳固定的中心代谢物为出发点来提高合成效率。最近,研究结果表明蓝藻的碳代谢具有一定的可塑性,可以将碳流重定向至一些低通量的途径,以便直接从二氧化碳合成目标化学品。莽草酸通路是植物和微生物中碳代谢中心和芳香氨基酸(AAAs)网络之间的代谢桥梁,是天然芳香化合物的重要来源途径。然而,蓝藻中莽草酸途径的可塑性还未被研究,因而我们以2-苯乙醇为目标化合物,探究蓝藻中莽草酸途径的可塑性。我们构建了两种2-苯乙醇的人工生物合成途径,并将其导入到蓝藻的模式菌株Synechococcus elongatus PCC7942中,实现了直接利用CO_2合成2-苯乙醇。随后,构建了一种解反馈抑制模块(FBR模块),并把它和醇脱氢酶引入到上述2-苯乙醇生产的工程菌株中。与野生型菌株相比,工程光合菌株P120的2-苯乙醇的产量最高可达119.5 mg L~(-1),固碳率和光合放氧分别提高了68.7%和29.9%,其中30%以上的固定碳被重定向到莽草酸途径来进行芳香化合物的合成。结果表明,由于引入的2-苯乙醇合成双途径和FBR模块的协作在工程蓝藻菌株中产生了一个“陷阱点”,创建了一个强大的“碳流陷阱”,它将碳流重新定向至低通量的莽草酸途径,从而直接从二氧化碳中产生有价值的芳香族化合物。结合基因转录水平测定分析,FBR模块导入后导致了工程菌电子链的重构,使得电子传递、光能捕获的效率提高和代谢流的重定向。这一发现为为提高植物光合效率和人工光合自养体系设计提供了指导。1,3-丙二醇、2-苯乙醇及其衍生物有着广泛的应用,同时在微生物代谢中具有重要的生理作用。本论文通过代谢工程改造微生物,研究了工程菌株进行生物合成过程中异源表达模块的不适配问题及代谢途径的可塑性。本论文研究的开展,有助于提升我们对光合生产不适配和代谢途径可塑性的了解,并将为代谢工程改造微生物合成其他目标化合物提供帮助。


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