水稻条斑病菌T3SS基因诱导表达体系的建立

【摘要】：水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)侵染寄主水稻,引起水稻细菌性条斑病(Bacterial leaf streak,BLS),在亚洲水稻种植区引起严重减产。Xoc主要依靠hrp基因簇(T3SS基因)编码的III型分泌系统(type III secretion system,T3SS)将效应蛋白运送到寄主细胞中,并激发水稻的抗(感)性。T3SS作为Xoc关键毒性因子,是Xoc毒性调控网络的重要组成部分,但尚且缺乏有效解析Xoc毒性调控网络的诱导表达体系。为了更好地解析Xoc毒性调控网络,本研究建立了一套从转录水平到蛋白表达水平的Xoc T3SS诱导表达检测体系。为建立T3SS转录水平报道检测体系,本研究利用gusA报道基因构建获得启动子探针载体pHG2-hrpGxoc、pHG2-hrpXoc、pHG1-hrcCxoc。通过启动子GUS活性测定和荧光定量PCR,初步证明了这套转录水平报道检测体系在XOM3诱导条件下运行和解析基因转录调控表达情况。为进一步确定这套体系可以精确分析基因调控表达,将上述启动子探针载体导入调控基因trh、zur、lrpX的突变体菌株中,XOM3诱导下进行启动子GUS活性测定,结果表明这套检测体系可以有效进行T3SS基因转录水平的基因调控表达。将pHG2-hrpXoc导入RS105和R?hrpG中,注射接种到非寄主烟草和寄主水稻叶片,进行GUS活性定量测定及细菌生长量测定,结果表明hrpX在R?hrpG中的转录水平与已知调控模式一致,说明这套体系可以有效应用于在“Xoc-活体植物组织”互作中进行转录水平的基因调控表达分析,是互作技术体系中的一大创新。为更精确地解析Xoc T3SS基因蛋白表达情况,本研究利用合成生物学的方法,构建获得蛋白表达载体pHM1-hrpGxoc::3myc、pH1-hrpGxoc::3myc、pH3-hrpGxoc::flag、pHM1-hrpXoc::flag、pH1-hrpXoc::flag、pH3-hrcCxoc::flag。将pHM1-hrpGxoc::3myc、pH1-hrpGxoc::3myc、pHM1-hrpXoc::flag、pH1-hrpXoc::flag导入RS105和R?hrpG中,进行蛋白免疫杂交,结果表明这套蛋白表达检测体系可以正常运行。将pH3-hrpGxoc::flag、pH1-hrpXoc::flag、pH3-hrcCxoc::flag分别导入R?trh、R?zur、R?lrpX中,XOM3诱导条件下进行蛋白免疫杂交,结果发现hrpG、hrpX和hrcC基因的蛋白表达水平和转录水平一致,证明这套蛋白表达检测体系的可以有效解析基因蛋白表达。将pHM1-hrpGxoc::3myc、pH1-hrpGxoc::3myc的质粒导入RS105和R?hrpG中,注射接种感病水稻IR24的叶片,通过观察水渍状病斑发现这两个质粒都可以恢复R?hrpG在寄主水稻上的致病性,说明这套蛋白表达载体也可以有效应用于功能互补分析。综合上述结果表明,本研究建立的Xoc T3SS基因诱导表达检测体系,在Xoc与XOM3培养基,寄主和非寄主组织的互作体系中,可有效应用于基因调控表达分析和解析Xoc毒性调控网络,鉴定关键致病性毒性基因,有助于开发针对致病靶基因的防治水稻条斑病菌的农药和抗病水稻品种的选育。