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百子莲ApSBT剪切本在超低温保存诱发PCD中的作用

刘沛林  
【摘要】:类枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin-like proteases,SBT)一类是与植物发育、防御反应相关的多功能的丝氨酸蛋白酶。本研究基于百子莲(Agapanthus praecox ssp.orientalis`Big Blue`)超低温保存中的转录组数据,筛选、克隆出全长的ApSBT基因,并发现了其剪切本ApSBT.2。ApSBT.1和ApSBT.2 mRNA序列长分别为2316 bp和2468 bp,其中ApSBT.1编码771个氨基酸,预测蛋白大小为82.69 kDa。由于ApSBT.2发生了内含子保留型可变剪切,保留的内含子上含有一个终止密码子,使得翻译后蛋白序列仅含有115个氨基酸,预测蛋白大小为13.18 kDa。ApSBT.1属于Peptidases S8家族的亲水蛋白,具有典型的类枯草杆菌蛋白酶I9和S8结构域;而ApSBT.2仅包含一个类枯草杆菌蛋白酶的I9结构域。同源序列对比分析可知,百子莲SBT蛋白与棕榈科和禾本科等单子叶植物的SBT遗传进化关系较近。亚细胞定位分析ApSBT.1主要位于细胞质,ApSBT.2主要位于细胞膜,但分子功能差异未知。研究发现,百子莲EC(embryonic callus)超低温保存中ApSBT.1和ApSBT.2基因的表达响应了超低温复合逆境;模式植物辅助验证,表明在转基因拟南芥(Arabidopsis thaliana)超低温保存后ApSBT.1降低了冻后成活率,而ApSBT.2则对冻后成活率略有提高。对转基因拟南芥超低温保存中DNA ladder、TUNEL、ROS水平、膜脂过氧化程度以及PCD(Programmed Cell Death)相关的类caspase酶活进行检测,发现转ApSBT.1和ApSBT.2基因拟南芥超低温保存中OH~-为参与氧化应激的ROS主要组分,转ApSBT.1基因拟南芥膜脂过氧化程度显著高于野生型,而转ApSBT.2基因拟南芥略低于野生型。另外,ApSBT.1提高了caspase-1、-3和-6蛋白水解酶的活性,而ApSBT.2减弱了caspase-6蛋白水解酶的活性。过表达ApSBT.1提前并加剧了百子莲超低温保存中PCD进程,而ApSBT.2则减弱了PCD进程,并表现出部分抑制ApSBT.1的功能,提高了植物体抵御超低温保存复合逆境胁迫的能力。同时探究了ApSBT.1和ApSBT.2在超低温保存单一非生物胁迫中的功能。在转基因拟南芥单一胁迫成活率实验中,ApSBT.1在氧化胁迫下成活率最低,仅为野生型的0.68倍,ApSBT.2在盐胁迫下成活率最高,为WT的1.4倍。在单一胁迫下的表达量、成活率差异说明ApSBT.1和ApSBT.2应对非生物胁迫的响应模式不同,但相关机制有待进一步研究。综上所述,本实验初步揭示了类枯草杆菌蛋白酶在非生物胁迫诱导PCD中的作用,为后续进一步开发蛋白酶型冷冻保护剂提供了理论依据。


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