黄瓜黄叶基因YL的定位及其遗传转化

【摘要】：叶是植物光合作用、呼吸和营养转化的重要器官,叶色直接影响植物光合作用的效率。黄瓜(Cucumis sativus L.)叶色突变易于鉴定,是黄瓜叶色基因克隆以及研究黄瓜光合作用的优良材料。本研究利用黄瓜自交系WD_1经EMS诱变获得了一个稳定遗传的黄叶突变体(yellow leaf,yl)。以yl突变体为父本,黄瓜自交系S52为母本构建了F_2分离群体,对亲本、F_1以及F_2群体的叶色表型调查分析,表明yl突变是受单个隐性核基因控制的质量性状。利用混合分组分析法(Bulked Segregant Analysis,BSA)结合277株F_2群体的分析,对YL基因进行了定位。通过对定位区间候选基因的预测和重测序数据的比对分析,初步确定了候选基因,并对该基因进行了遗传转化分析。主要研究结果如下:1.以yl突变体为父本,黄瓜自交系S52为母本构建了F_2群体。对yl突变体、S52、F_1及F_2群体277个单株进行叶色性状调查和遗传分析,结果表明该突变体受一个隐性核基因控制,并且绿色对黄色为完全显性。2.对yl黄叶突变体进行了色素含量和光合性能的测定。yl突变体的总叶绿素、叶绿素a和叶绿素b的质量分数都显著低于S52,而类胡萝卜素含量比S52高。yl突变体的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、光化学猝灭系数(q P)初始荧光F_0均低于S52。胞间二氧化碳浓度(Ci)二者没有明显差异。3.基于BSA法,通过筛选得到的DNA池间多态性SSR标记将YL基因初步定位于4号染色体上SSR15682和SSR05415标记之间。进一步开发In Del标记,最终将基因定位在In Del4-9和In Del4-10之间,物理距离为936.39kb的区间内。4.用20株黄化苗DNA混池进行基因组重测序,通过黄化苗DNA混池基因组重测序数据和课题组已有的自交系WD_1、S52重测序数据以及9930基因组数据,对定位区间内基因进行序列比对分析,推测Csa4G297530为候选基因。5.通过构建植物表达载体p CAMBIA2300-Pro(Csa4G297530)-Csa4G297530CDS-YFP,将此载体转化到根瘤农杆菌,然后利用农杆菌介导法对黄瓜WD_1品种进行遗传转化,获得89棵苗,经PCR检测尚未获得阳性苗。本研究通过EMS诱变获得了一个稳定遗传的黄叶突变体yl,通过图位克隆的方法定位、克隆了YL基因,该基因的克隆为揭示黄瓜叶色变异的分子机理奠定了一定的基础。遗传转化体系的优化也为黄瓜转基因奠定了基础。