肺炎克雷伯氏菌基因转化技术的研究

【摘要】： 现有的外源DNA引入肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的方法与外源基因转化大肠杆菌的方法雷同,就是用克雷伯氏菌质粒电穿孔转化克雷伯氏菌。虽然文献报道这种策略转化克雷伯氏菌效率很高,但是过去十余年来几乎没有人引用。我们采用这种方案转化克雷伯氏菌,转化效率只有103/μg质粒。这种低水平的转化效率,限制了克雷伯氏菌的分子生物学研究。 造成克雷伯氏菌低水平的转化效率可能与克雷伯氏菌厚厚的荚膜有关。这层荚膜既降低了细菌比重,很难离心回收细菌;又使电击或化学法在细菌表面打孔的难度加大。 我们采用荚膜合成缺陷株Mag A-,可以将细菌的转化效率提高1-2个数量级,证实荚膜的确是克雷伯氏菌有效转化的障碍。但是,转化效率还是不能与大肠杆菌的转化效率相比,提示还有其它的因素影响细菌的转化效率。我们尝试直接用质粒电穿孔转化固体培养基培养的肺炎克雷伯氏菌。出乎我们的意料,与液体培养基培养的克雷伯氏菌相比,固体培养基培养的克雷伯氏菌转化效率至少可以提高3个数量级。利用激光共聚焦显微镜观察,发现固体培养基培养的细菌形态、细菌间融合状态与液体培养基培养的克雷伯氏菌差异很大,提示细菌的细胞形态能够显著影响克雷伯氏菌的转化效率。基于这些观察,我们建立了克雷伯氏菌高效转化技术。我们正在利用该技术将一些外源基因引入克雷伯氏菌中表达,以及利用基因同源重组技术有目的地改造克雷伯氏菌的代谢途径,制造有用的工程菌株。