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糖尿病肾病血清标记物的筛选及发病机制研究

陈海冰  
【摘要】: 第一部分蛋白质组学方法筛选早期糖尿病肾病血清标记物 目的: 运用蛋白质组学方法筛选早期糖尿病肾病患者血清标记物,探讨其与糖尿病肾病发病的关系。 对象与方法: 采用凝胶分级与质谱联用的方法对5例男性健康对照混合血清和5例男性2型糖尿病患者混合血清进行差异蛋白质组分析。在蛋白质组质谱分析出差异蛋白的基础上收集96例上海地区中国人血清(年龄20~69岁,分4组:健康对照组(n=24)、2型糖尿病正常白蛋白尿组(Normoalbuminuria NA)(n=24)、2型糖尿病微量白蛋白尿组(Microalbuminuria MA)(n=24)和临床蛋白尿组(Clinical proteinuria CP)(n=24)),用Western blot方法验证血清差异蛋白表达量并进行比较;同时常规检测血糖、糖化血红蛋白(HbA1c)、血脂谱、高敏C反应蛋白、肾功能及尿微量白蛋白排泄率(AER),根据肾脏病膳食改良试验(Modification of Diet in Renal Disease,MDRD)公式计算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,eGER)。结果: 1.蛋白质组分析结果: 1)健康对照组共鉴定到3,010种蛋白,糖尿病患者组共鉴定到3,224种蛋白。 2)两组间血清蛋白质差异主要位于低丰度蛋白区,健康对照组有13种蛋白表达上调;糖尿病患者组有29种蛋白表达上调。其中,纤维胶凝蛋白(ficolin3)在糖尿病患者组显著上调。 3)通路预测和定量偏好性分析见到,血清补体和凝血级联系统中蛋白质的表达水平在糖尿病患者血清中表现出显著上调的定量偏好性。 2.差异蛋白ficolin3验证结果: 1)NA组血清ficolin3水平显著高于健康对照组(P0.05);MA组患者血清ficolin3水平(2.13±1.34)显著高于健康对照组(0.89±0.43)(P 0.01)和NA组(1.42±0.88)(P0.01)。 2)早期糖尿病肾病患者血清ficolin3水平与HbA1c、LDL-c、AER独立相关(R= 0.263、0.321、和0.245,P0.01)。Logistic回归分析发现ficolin3是早期糖尿病肾病的独立相关变量(比数比=2.37,P0.05)。 3)临床蛋白尿组患者血清ficolin3水平(1.05±0.71)与健康对照组及NA组比较无显著性差异,但是显著降低于MA组(2.13±1.34)(P0.01)。Pearson相关分析结果表明该组患者血清ficolin3水平与eGFR显著正相关(R = 0.446, P = 0.029);与血糖、血脂、AER和hs-CRP无显著相关(P0.05)。 4)在NA组或MA组内有视网膜病变患者与无糖尿病视网膜病变患者的血清ficolin3水平之间无显著性差异(P0.05)。 结论: 1.糖尿病患者血清中有29种蛋白表达上调,健康对照中有13种蛋白表达上调;糖尿病患者血液中存在补体系统和凝血系统级联激活。 2.Ficolin3可能是早期糖尿病肾病的血清标记物,而且与糖尿病肾病晚期病变程度有关。 3.蛋白质组方法是疾病生物标记物筛选的有效手段。 第二部分糖尿病肾病患者血清色素上皮源因子的变化及意义 目的: 色素上皮源因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)与糖尿病大鼠肾病发病密切相关。目前尚未见到血清PEDF水平与糖尿病肾病关系研究的报导,它在人体内的病理生理意义仍需进一步研究。本研究主要通过临床研究探讨血清PEDF水平在糖尿病肾病患者中的变化;血清PEDF与糖尿病肾病的关系。 材料与方法: 收集46例健康对照、166例不同程度糖尿病肾病(糖尿病正常蛋白尿(NA)组n=59例、微量白蛋白尿(MA)组n=68例、临床蛋白尿(CP)组n=39例)患者血清,用ELISA方法检测其血清PEDF水平。检测HbA1c、血脂谱、高敏C反应蛋白(high sensitive C reactive protein, hs-CRP)、肾功能及24h尿微量白蛋白排泄率(albuminuria excretion rate,AER),根据肾脏病膳食改良试验(Modification of Diet in Renal Disease,MDRD)公式计算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,eGER)。 结果: 1.糖尿病肾病微蛋白尿和临床蛋白尿患者血清PEDF水平显著高于健康对照组(P0.01)和NA组(P 0.05),并随着肾脏病变阶段的进展而逐渐升高。 2. Pearson相关分析表明血清PEDF水平与年龄(R=0.242, P0.01)、收缩压(R=0.147, P0.05)、舒张压(R=0.224, P0.01)、体重指数(R=0.162, P 0.01)、甘油三脂(triglyceride,TG)(R=0.189, P0.01)、高密度脂蛋白-胆固醇(R=-0.154, P0.05)、hs-CRP (R=0.268, P 0.01)、AER (R=0.359, P 0.01)、eGER(R=-0.417, P 0.01)显著相关。多元回归分析发现血清PEDF水平与eGFR(R=-0.368, P 0.01)、TG(R=0.279, P 0.01)和AER(R=0.180, P 0.01)独立相关。 3.以eGFR 90ml?min-1?1.73m2作为分界限,将各组患者分为GFR正常和GFR异常组两个亚组,比较后发现各组内GFR正常和GFR减低亚组间比较均有显著性差异(P0.05)。 结论: 1.糖尿病肾病患者血清PEDF水平代偿性升高; 2.血清PEDF水平与糖尿病肾病发病有关。 第三部分血管紧张素II 1受体拮抗剂对2型糖尿病肾病患者血清和尿液VEGF水平的影响 目的: 动物研究发现肾素血管紧张素系统抑制治疗可有效降低糖尿病肾组织血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达,缓解其组织损伤。故推测ARB类药物有降低糖尿病患者VEGF水平的作用。本研究通过ARB类药物厄贝沙坦的干预治疗,观察糖尿病肾病患者血清和尿液VEGF的改变及ARB对糖尿病肾病患者血清和尿液VEGF水平的影响,探讨ARB对DN保护性作用机制。 材料与方法: 对46例健康对照、166例不同程度糖尿病肾病(糖尿病正常蛋白尿(NA)组n=59例、微量白蛋白尿(MA)组n=68例、临床蛋白尿(CP)组n=39例)以及实施6个月厄贝沙坦治疗的18例高血压糖尿病合并微量白蛋白尿患者血清及尿液,用ELISA方法检测其VEGF水平。另外,常规检测HbA1c、血脂谱、高敏C反应蛋白(high sensitive C reactive protein, hs-CRP)、肾功能及24h尿微量白蛋白排泄率(albuminuria excretion rate,AER),根据肾脏病膳食改良试验(MDRD)公式计算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,eGER)。 结果: 1.糖尿病正常蛋白尿组血清VEGF水平显著高于健康对照组(P 0.05),MA组、DN组和健康对照组之间比较,血清VEGF水平均无显著性差异(P0.05)。Pearson相关分析表明血清VEGF水平仅与BMI(R=0.194, P 0.01)、HbA1c (R=0.124, P0.05)显著相关;与AER、eGFR无显著相关。 2.尿VEGF水平在糖尿病患者显著增加并随着肾病阶段的进展而逐渐升高。Pearson相关分析表明尿VEGF水平与年龄(R=0.344, P 0.01)、病程(R=0.249, P 0.01)、收缩压(R=0.354, P0.01)、HbA1c(R=0.215, P 0.01)、高密度脂蛋白胆固醇(R=-0.167, P0.05)、hs-CRP (R=0.359, P 0.01)、AER(R=0.452, P 0.01)、eGER(R=-0.316, P 0.01)显著相关。多元回归分析结果表明尿VEGF水平与AER (R=0.268, P 0.01)、hs-CRP (R=0.2, P 0.05)、病程(R=0.167, P 0.05)和年龄(R=0.163, P 0.05).独立相关。 3.厄贝沙坦干预治疗后尿微量白蛋白缓解组尿液VEGF水平显著降低(P 0.01);尿蛋白未缓解组尿VEGF水平无显著改变(P 0.05)。血清VEGF水平在治疗前后在缓解组和未缓解组均未见有显著差异。相关分析表明,尿液VEGF水平的变化值与尿微量白蛋白的变化值在调整了血压改变之后仍显著相关(R=0.57, P 0.01)。 结论: 1.尿VEGF水平与糖尿病肾病相关,未见到血清VEGF水平与糖尿病肾病显著关联。 2.ARB治疗可显著减少蛋白尿,并降低患者尿VEGF水平。VEGF可能ARB是糖尿病肾病治疗干预的有效靶点。 结论 1.蛋白质组方法是疾病生物标记物筛选的有效手段。 2.糖尿病患者血清中有29种蛋白表达上调,健康对照中有13种蛋白表达上调;糖尿病患者血液中存在补体和凝血级联系统激活。 3.Ficolin3可能是早期糖尿病肾病的血清标记物,而且与糖尿病肾病晚期病变程度有关。 4.糖尿病肾病患者血清PEDF水平代偿性升高;血清PEDF水平与糖尿病肾病发病有关。 5.尿VEGF水平与糖尿病肾病有关,血清VEGF水平与糖尿病肾病无关;厄贝沙坦治疗可显著降低蛋白尿水平,减少患者尿VEGF水平;提示VEGF可能是糖尿病肾病干预的有效靶点。


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