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海绵共附生活性菌PKS和NRPS基因的筛选及多样性研究

张薇  
【摘要】: 利用PCR技术对分离自我国南海的细薄星芒海绵Stelletta tenusis,皱皮软海绵Halichondria rugosa,贪婪掘海绵Dysidea avara和澳大利亚厚皮海绵Craniella australiensis共附生的109株细菌基因组进行了聚酮合酶(PKS)基因和非核糖体肽合成酶(NRPS)基因的筛选研究,同时对具有PKS、NRPS基因的细菌进行抑菌活性研究。 获得了16条690 bp的PKS基因片段, BLAST比对结果表明该基因对应的氨基酸序列和枯草芽孢杆菌I型聚酮合成酶(PKS)的KS域的相似性达91%以上。通过系统发育分析推测16株活性菌的PKS基因属于trans-AT型。 同时,克隆到15条1000 bp的NRPS基因片段, BLAST比对结果表明该基因对应的氨基酸序列和NRPS的腺苷酰化结构域(Adenylation, A) domain相似,大部分序列(10/15)的相似度在70%以下,具有较高的新颖性。通过16S rDNA和A domain系统发育分析结合Blast结果发现,15株菌中,在6株活性菌中存在未见报道的NRPS基因,7株菌中同时存在NRPS基因和PKS基因。 26株细菌的16S rDNA的测序结果经过BLAST和系统发育树分析,分组成3个类别:变形菌门(2/26),放线菌门(2/26)和厚壁菌门(22/26)。其中菌株DA20和菌株DA23最近似菌属于放线菌,菌株A05和菌株A11的最近似菌为变形菌门的产碱菌,厚壁菌门组里的菌株除缓慢葡萄球菌A75之外,大部分属于芽孢杆菌。 26株含有PKS基因或NRPS基因的细菌显示了广谱的抑菌活性,抑菌范围包括了真菌,革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌。 研究证明:(1)中国南海四种海绵共附生微生物中存在PKS及NRPS基因簇,这两种基因簇在这4种海绵共附生微生物中广泛存在,并分布在多种类型的细菌中,包括了变形菌门,厚壁菌门以及放线菌。(2)海绵共附生微生物中芽孢杆菌属富含NRPS或PKS基因簇。16S rDNA序列分析证明了带有PKS或NRPS基因簇的26株活性菌有较高的生物多样性。PKS、NRPS基因同源性分析也显示较高的多样性和新颖性。这两种基因多样性和新颖性的研究为进一步发掘产生新活性物质的菌株奠定了基础。 本研究推测PKS/NRP在海绵共生活性菌与海绵的共生关系中起到帮助宿主防御外来侵害的作用,为海绵活性物质的微生物来源假说提供了证据。


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