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利用毕赤酵母表达小C肽人胰岛素原的研究

张田  
【摘要】: 胰岛素(Insulin)是临床治疗糖尿病的特效药,具有广阔的应用前景。重组人胰岛素基因曾被成功地在大肠杆菌(Escherichia coli)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表达,但是存在着难以复性和表达量较低等缺点。毕赤酵母(Pichia pastoris)具有严格调控外源蛋白的表达、加工修饰表达产物、表达量高、营养要求低等优点成为表达外源蛋白的理想表达系统。 本研究根据植物偏爱密码子化学合成了小C肽人胰岛素原全基因(B-(H)6LQPK-A),将该小C肽人胰岛素原基因(BC’A)插入到酵母表达载体pPICZαA中,经线性化后,电击法转化毕赤酵母GS115,利用PCR筛选出了阳性转化菌株,从而成功构建了人胰岛素原的毕赤酵母表达体系。阳性菌株经甲醇诱导培养,发酵液上清液经Tricine-SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,发现3株菌株(1#,13#,20#)成功表达了人胰岛素原,同时研究了20#菌株的表达量随时间的变化关系,揭示了His-tag位于C肽时对分离纯化的影响,为进一步研究该基因在P. pastoris和转基因植物中的表达奠定了基础。


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