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烟曲霉菌对呼吸道上皮细胞结构和功能的影响

龙飞  
【摘要】: 烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus, A.fumigatus)是一种分布广泛的真菌,其孢子体积很小,易于进入呼吸道,是一种常见的呼吸道过敏原,生长过程中可以释放多种蛋白酶,在哮喘发病中的作用近年来逐渐受到重视。呼吸道上皮细胞在过敏原致敏和哮喘发作中起着非常重要的作用。本实验从动物哮喘模型和体外细胞培养两个方面阐述烟曲霉菌对呼吸道上皮细胞的作用及机制,进一步阐明烟曲霉菌在哮喘早期致敏和加重发病中的作用机制。 第一章烟曲霉菌孢子对大鼠呼吸道结构和功能的影响 目的:探讨烟曲霉菌孢子对正常和哮喘大鼠呼吸道上皮细胞结构和功能的影响。 方法:应用OVA致敏的方法建立大鼠的哮喘模型。应用烟曲霉菌孢子给予滴鼻后观察烟曲霉菌孢子对正常和哮喘大鼠的气道反应性。测定肺泡灌洗液(BALF)粘液蛋白Muc5ac和粒-巨细胞集落刺激因子GM-CSF水平。 结果:接触烟曲霉菌孢子的大鼠与正常大鼠比较,BALF上清中Muc5ac和GM-CSF明显增高,气道对乙酰胆碱反应性明显增高。接触烟曲霉菌孢子的哮喘大鼠与未接触烟曲霉菌孢子的哮喘大鼠相比,前者BALF内Muc5ac和GM-CSF水平和气道对乙酰胆碱的反应性明显高于后者。 结论:烟曲霉菌孢子可以增加正常和哮喘大鼠气道反应性,促进气道合成分泌Muc5ac和GM-CSF。烟曲霉菌可能通过上述的途径促进大鼠哮喘发生和加重其发展。 第二章烟曲霉菌提取物对人支气管上皮细胞的作用 目的:探讨烟曲霉菌对呼吸道上皮细胞的作用及其可能机制。 方法:制备并鉴定烟曲霉菌提取物(AFE),观察AFE体外培养人支气管上皮细胞(16HBE-14o)的跨上皮细胞电阻(TER)、紧密连接结构蛋白occludin和ZO-1、细胞体外修复功能、细胞合成分泌Muc5ac和GM-CSF的作用。应用热处理-AFE(HT-AFE)、丝氨酸蛋白酶抑制剂、蛋白激酶激活受体-2(PAR-2)的激动剂或者阻断剂进一步研究其可能机制。 结果:制备的AFE具有明显的蛋白酶活性和丝氨酸蛋白酶活性,且热处理(65℃,30min)后其蛋白酶活性完全消失,应用2mg/L抑肽酶可以完全抑制其丝氨酸蛋白酶活性。160mg/L AFE作用4h不影响细胞的活力和细胞上清中的乳酸脱氢酶的水平。 40-160mg/L AFE作用于单层极化细胞的基底层时作用6min左右可以引起TER快速短暂的降低,随后逐渐恢复而后在4h又逐渐降低。而作用于单层极化细胞的上层时并没有出现快速短暂的降低,只出现一个随时间逐渐降低的过程。应用PAR-2激活肽可以模拟6min时的快速短暂的降低。应用免疫荧光和Western blot检测发现AFE可以明显降解紧密连接结构蛋白occludin,并呈浓度和时间依赖关系。而对ZO-1没有明显的影响。另外抑肽酶可以抑制AFE对细胞TER和occludin的作用。HT-AFE对细胞TER和occludin没有明显影响。 20-40mg/L AFE可以明显降低细胞的体外损伤修复功能、细胞移动功能、细胞的粘附功能和细胞的伸展功能,而HT-AFE对细胞的上述修复功能指标没有明显的作用。 8-24mg/LAFE可以促进上皮细胞合成和分泌Muc5ac和GM-CSF,呈明显的浓度和时间依赖性,同时AFE明显促进Muc5ac和GM-CSF的mRNA的表达,且抑肽酶和PAR-2受体阻断剂(FSLLRY-NH2)可以明显抑制AFE对Muc5ac和GM-CSF的作用。PAR-2激活肽(SLIGLV- NH2)可以刺激细胞产生GM-CSF。另外HT-AFE对Muc5ac和GM-CSF没有明显的作用。 结论:40-160mg/L AFE可以通过刺激PAR-2受体和直接降解紧密连接蛋白occludin来降低细胞的屏障功能。20-40mg/L AFE可以降低细胞的体外损伤修复功能。8-24mg/L AFE可能通过激活PAR-2受体促进细胞合成分泌Muc5ac和GM-CSF。烟曲霉菌可能通过上述的作用途径促进哮喘过敏原的致敏和加重哮喘的发作程度。PAR-2和蛋白酶抑制剂可能成为未来预防和治疗哮喘的靶点和新的治疗途径。


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