SurKex诱导survivin基因沉默的分子机理研究

【摘要】： Survivin是凋亡抑制蛋白家族成员,具有调控有丝分裂和抑制细胞凋亡的作用。Survivin在大多数结束分化的正常组织中均未被检测到,但在几乎所有的肿瘤组织中均过量表达,并为肿瘤细胞生存所必须。因此,survivin被公认为是癌症治疗的一个重要靶点。 研究发现,用一正义的短链甲基化寡核苷酸与某一基因启动子区序列互补,可以诱导该基因启动子区甲基化而抑制基因转录。利用这一机制来抑制致病基因的表达,应能起到治疗疾病的作用。据此,我们设计了一个与survivin基因启动子区域互补的22个碱基的甲基化脱氧寡核苷酸SurKex,在早期的工作中,我们通过体内外的药效学实验已经证明,SurKex能抑制survivin mRNA和蛋白的表达,并对荷瘤鼠肿瘤生长有抑制作用,且能延长荷瘤鼠的存活时间。同时,对SurKex作用机理也进行了初步研究,结果表明,它是通过诱导survivin启动子区域发生甲基化而导致基因沉默的。 在前期工作的基础上,本文首先对SurKex诱导survivin启动子部位甲基化的作用方式进行了更深入的研究,通过亚硫酸氢钠测序法,确证了SurKex诱导survivin启动子部位发生甲基化的方式是靶向、定点诱导。i 基因沉默时,与之结合的组蛋白往往会发生一些共价修饰的改变,所以接下来的研究,我们主要考察了SurKex诱导survivin沉默后,与survivin启动子区结合的组蛋白H3、H4上特定的赖氨酸残基的甲基化水平及H3、H4的乙酰化/去乙酰化水平是否发生相应的改变。我们采用染色质免疫沉淀技术,通过特异性抗体进行分析,结果表明,SurKex作用后,与survivin启动子区结合的组蛋白H3-K9二甲基化、H3-K27三甲基化水平升高;H4乙酰化、H4-K16乙酰化水平降低,也即去乙酰化水平升高。组蛋白的这些改变,与基因沉默是呈正相关的。 DNA甲基化和组蛋白的共价修饰,都是调控基因表达的重要表观遗传学生化事件。关于二者之间的因果关系,进行调控的先后顺序,一直是表观遗传学领域研究的热点。在我们的实验中,SurKex作用后,既引起DNA甲基化,又引起组蛋白尾部修饰的改变。它们之间是如何彼此协作、控制survivin的开或关,更确切地说,是DNA甲基化指导组蛋白共价修饰的改变,还是组蛋白共价修饰的改变指导DNA甲基化,是我们接下来的研究要解决的关键问题。我们选用DNA甲基化酶抑制剂5-氮脱氧胞嘧啶核苷(5-Aza-CdR)、组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)和组蛋白甲基化酶抑制剂BIX-01294,分别考察DNA甲基化或组蛋白去乙酰化或甲基化作用被相应抑制剂阻断后,对SurKex效应的影响,以此阐明DNA甲基化和组蛋白共价修饰(去乙酰化和甲基化)在survivin沉默中的因果关系和调控顺序。具体方法是通过RT-PCR考察survivin mRNA表达情况、Bisulfite sequencing分析survivin启动子区特定CpG甲基化情况及染色质免疫沉淀(ChIP)实验考察与survivin结合的组蛋白共价修饰情况。实验结果表明,DNA甲基化是survivin沉默中最关键的一步,但组蛋白去乙酰化和甲基化指导DNA甲基化,它们的作用途径可能与DNA甲基化转移酶1(DNMT1)有关。 最后,我们想初步验证对上述实验结果的推论是否正确。我们用TSA和BIX-01294分别阻断组蛋白去乙酰化和甲基化后,用RT-PCR考察对DNMT1 mRNA表达的影响。结果表明,组蛋白去乙酰化和组蛋白甲基化被相应的抑制剂阻断后,都出现了DNMT1 mRNA表达的降低。由此可见,组蛋白去乙酰化和甲基化都可能通过上调DNMT1 mRNA表达而影响DNA甲基化。当然,这可能只是它们作用途径中的一个环节。 本课题的研究首先确证了SurKex为一种新型的靶向、定点甲基化诱导剂,它通过诱导survivin基因启动子区特定CpG位点甲基化而引起survivin沉默;其次阐明了SurKex在诱导survivin沉默的过程中,除了DNA甲基化之外,组蛋白H3-K9二甲基化、H3-K27三甲基化水平升高,组蛋白H4、H4-K16乙酰化水平降低;接着,以SurKex为工具药,初步阐明了在survivin沉默过程中,DNA甲基化是最关键的一步,但组蛋白共价修饰的改变(组蛋白去乙酰化和甲基化)是更优势的事件,它指导DNA的甲基化;最后,初步证明组蛋白共价修饰的改变(组蛋白去乙酰化和甲基化)是通过影响DNMT1 mRNA的表达,来指导DNA甲基化。 本课题的研究不但为抗肿瘤药物的设计提供了新的思路,提供了从表观遗传学角度靶向治疗癌症的一种新方法,而且为解决表观遗传学领域的重大理论问题提供了实验证据。