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α7烟碱型乙酰胆碱受体激动剂对细胞损伤与保护的影响

周颖  
【摘要】: α7烟碱型乙酰胆碱受体不仅在神经细胞上表达,而且在非神经细胞,例如内皮细胞、巨噬细胞、上皮细胞和肿瘤细胞等均有分布表达,参与这些细胞的功能调节,并与一些疾病的病理生理变化相关。将α7烟碱型乙酰胆碱受体作为靶点开发的受体激动剂已用于多种疾病的治疗。 研究目的: 流行病学研究表明吸烟能导致多种心血管疾病,尼古丁作为香烟中主要有毒成分在其中起着重要的作用,但其作用机制并不十分清楚。同时,尼古丁在阿尔茨海默病中起到保护神经细胞和提高认知能力的作用。尼古丁作为α7烟碱型乙酰胆碱受体激动剂,可能是通过激活受体发挥作用。本研究目的是探讨尼古丁通过直接、间接刺激对脐带静脉血管内皮细胞表达粘附分子的影响及其作用机制,然后探讨gx-50—一种通过药物软件分析筛选获得的特异性α7烟碱型乙酰胆碱受体激动剂对淀粉样蛋白诱导的大鼠皮质神经细胞损伤的影响。研究方法: 首先,采用不同浓度的尼古丁刺激巨噬细胞(Ana-1),在各时间点收集巨噬细胞培养上清测定上清中各细胞因子含量。并选择6×10~(-5)M,12小时处理组Ana-1细胞上清处理脐带静脉内皮细胞,收集各时间点内皮细胞的上清后检测其中的可溶性粘附分子。并用抗TNF-α,抗IL-1β,抗IFN-γ,抗TNF-α+抗IL-1β的单克隆抗体中和尼古丁处理的巨噬细胞上清液中相应的细胞因子,再观察其对血管内皮细胞粘附分子表达以及对白细胞粘附能力的影响。 其次,用不同浓度尼古丁刺激血管内皮细胞,收集细胞上清用酶联免疫吸附法检测前列腺素E2(PGE2)的表达。并提取细胞RNA与蛋白对环氧合酶2(COX-2)的表达进行检测。然后用α7烟碱型乙酰胆碱受体拮抗剂银环蛇毒素和NF-κB抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)预处理后观察COX-2和PGE2的表达,并用凝胶迁移实验检测尼古丁与抑制剂处理后NF-κB的转录水平变化。最后用COX-2抑制剂NS-398预处理细胞后观察尼古丁诱导的细胞间粘附分子-1蛋白表达变化。 最后,用不同浓度的gx-50处理大鼠皮质神经细胞,MTT法检测其对细胞活性的影响。用MTT和PI/Hoechst33258双染法观察gx-50预处理后对淀粉样蛋白诱导皮质神经细胞损伤的影响,用实时定量PCR和Western blot法检测相关凋亡基因的表达。最后用受体竞争性结合实验检测gx-50与α7乙酰胆碱受体的结合能力。 结果: IL-1β在6×10~(-5)M尼古丁处理后12小时达高峰,TNF-α在24小时达高峰。IL-8和IFN-γ的表达不受尼古丁的影响。用6×10~(-5)M的尼古丁处理Ana-1细胞12小时的上清刺激血管内皮细胞,能上调sICAM-1、sVCAM-1和E-selectin的表达。抗TNF-α,抗IL-1β,抗TNF-α+抗IL-1β单克隆抗体中和Ana-1上清中的相应细胞因子后,内皮细胞表达sICAM-1和sVCAM-1的量明显降低,且可以阻断单个核细胞与血管内皮细胞的粘附。此外,尼古丁可以浓度依赖性地增加COX-2基因表达和前列腺素E2的分泌,同时在乙酰胆碱受体拮抗剂银环蛇毒素和NF-κB抑制剂PDTC预处理后,这种表达增加明显得到了抑制。而且用COX-2抑制剂NS-398预处理后,尼古丁诱导的ICAM-1表达也得到了抑制。 在gx-50实验中,结果显示1×10-7~1×10~(-5)M的gx-50对皮质神经细胞活性没有显著的影响。在1×10~(-6)的gx-50预处理后,淀粉样蛋白诱导的神经细胞凋亡数量明显下降,并且使Bcl-2/Bax比率显著上升。另外,gx-50能够结合到大鼠皮质神经细胞表面的α7烟碱型乙酰胆碱受体。 结论: 综上所述,尼古丁作为α7烟碱型乙酰胆碱受体激动剂可以通过巨噬细胞分泌炎性因子TNF-α,IL-1β间接诱导内皮细胞表达粘附分子ICAM-1和VCAM-1。同时,尼古丁还可以通过α7乙酰胆碱受体及NF-κB途径直接刺激内皮细胞表达炎性因子,并诱导内皮细胞表达ICAM-1。此外,gx-50作为一种潜在的α7烟碱型乙酰胆碱受体激动剂能够有效地抑制Aβ25-35诱导的皮质神经细胞凋亡,gx-50是否是通过α7烟碱型乙酰胆碱受体介导的神经保护机制仍然需要进一步的研究证实。


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