Luteolin与MTT法对胃癌药物治疗的实验与临床研究

【摘要】： 胃癌在全世界有较高的发病率,每年全球因胃癌死亡的人数仅次于肺癌,位居第二位。特别在亚洲、南美和东欧其发病率一直较高。手术是目前唯一可能治愈胃癌的方式,但是仍有约三分之二的患者在诊断为胃癌时已是失去手术机会的进展期胃癌或已发生转移。Ⅳ期及非根治术、术后复发或转移的晚期患者化疗是主要治疗方法,以防止复发,提高生存率。但是目前胃癌患者化疗的效果较差,且化疗的毒副作用较大,其原因首先是传统的化疗药物疗效有限,不能有效抑制癌细胞的生长,第二是由于没有实现个体化治疗,肿瘤异质性的存在使胃癌细胞对标准的化疗药物或方案存在化疗抗性。因此,寻找新的治疗药物和优化化疗用药或方案成为提高胃癌疗效的当务之急。 论文第一章的研究目的:探讨luteolin对胃癌AGS细胞的抑制与化疗增敏作用,初步阐明luteolin的抗肿瘤机制,为luteolin治疗胃癌的下一步研究提供实验依据。研究方法:(1)用MTT法分别测定经不同浓度luteolin作用不同时间后AGS细胞的抑制率;(2)以流式细胞术分别测定经不同浓度luteolin作用后的细胞周期和凋亡及线粒体膜电位的变化情况;(3)用western-blot法分别测定细胞周期和凋亡调控的有关蛋白的表达情况;(4)用Chou–Talalay的联合指数法分别计算luteolin与其他抗肿瘤药物联用时的联合指数;(5)以流式细胞术测定luteolin与顺铂联用后的细胞凋亡变化;(6)用分子对接方法寻找luteolin增敏顺铂的潜在分子靶点;(7)用western-blot法测定luteolin与顺铂联用后p53蛋白的表达变化。实验结果:(1)luteolin能以剂量依赖和时间依赖的方式在体外抑制AGS细胞的生长;(2)经luteolin作用后,AGS细胞被阻滞与G2/M期并导致Cdc2、Cyclin B1和Cdc25C表达下降而p21/cip1上升;(3)经luteolin作用后,AGS细胞凋亡增加,并导致Bcl-2表达下降而Bax与P53表达上升,同时伴有Caspase-3、6和9的激活及细胞色素c的释放和线粒体膜电位的变化(;4)luteolin与顺铂联用时其联合指数小于0.8;(5)用分子对接方法发现luteolin与p53、BRCA1、JNK、JAK2和NF-κB具有较好的亲和性;(7)luteolin能稳定p53蛋白在细胞的存在。实验结论:通过阻滞细胞周期和诱导凋亡,luteolin能够有效的抑制胃癌AGS细胞的生长,同时它能增敏化疗药物cisplatin对AGS细胞的抑制和凋亡诱导作用。这些结果表明luteolin作为一种植物来源的黄酮类化合物能成为胃癌治疗的潜在药物。 论文第二章的研究目的:探讨luteolin对胃癌SGC-7901的放疗增强作用,初步阐明其机制。研究方法:(1)用克隆形成试验分别测定不同浓度luteolin与放疗联用后对SGC-7901细胞的生存率;(2)用AO/EB和TUNEL分别检测luteolin与放疗联用后对细胞凋亡的影响;(3)用western-blot法测定与细胞凋亡调控相关蛋白的表达情况;(4)用ELISA法测定PGE2的生成变化;(5)用western-blot法测定COX-2、VEGF、Ang1、Ang2和HIF-1α的表达变化;(6)在裸鼠负瘤模型上测定luteolin对放疗的增敏作用;(7)用免疫组化法测定瘤体内微血管密度的变化。实验结果:(1)luteolin能增强放射对SGC-7901的克隆集落形成抑制;(2)luteolin对放射导致的SGC-7901细胞凋亡具有增强作用;(3)luteolin能增强放射线处理过的SGC-7901细胞下调Bcl-2的表达,促进细胞色素c的释放和Caspase酶的激活;(4)luteolin能抑制PGE2的生成;(5)luteolin能下调VEGF、Ang1和HIF-1α的表达,同时增强Ang2的表达;(7)在裸鼠负瘤模型上luteolin能增强放射对肿瘤生长的抑制作用,并使血管生长受到抑制。实验结论:初步验证了luteolin的放疗增敏作用,表明luteolin是一种潜在的放疗增敏剂。 论文第三和第四章的研究目的:探讨MTT肿瘤药敏实验对胃癌化疗疗效的影响。研究方法:(1)回顾性分析本院胃癌患者的MTT肿瘤药敏实验资料和临床资料,分析不同胃癌分期和病理分型之间对抗癌药物的敏感率,在MTT敏感组和对照组之间,用Kaplan-Meier法分别分析患者的五年综合生存率,用COX风险比例模型来计算患者死亡的相对危险度hazard ratios,并分别比较其毒副反应的发生率;(2)收集MTT肿瘤药敏实验与胃癌疗效的相关文献资料,利用约克大学国立卫生服务中心综述评价标准评价这些文献资料后采集其中的数据,并用Meta分析的方法对这些临床数据进行定量整合,并评判MTT肿瘤药敏实验对所有胃癌化疗患者及其中TNM III和IV期亚组患者的三年综合生存率和病死率的影响,同时根据Meta分析的要求分析研究的敏感性、异质性和发表偏倚。研究结果:(1)16种化疗药物对胃癌标本的抑制率较高的几个药物依次为5-Fu、PY、CDDP、EPI和ACM,对不同病理分化类型与TNM分期之间的抑制率和有效率并无统计学差异;(2)MTT敏感组的5年生存率47.5%要优于对照组的45.1%,但是它们之间的差异未见有统计学意义,COX风险比例模型显示年龄60、肿瘤分型为III和IV期的女性病人对采用基于体外MTT药物敏感数据的化疗将会倾向于获得更加有益的临床疗效,两组间的毒副反应发生率MTT敏感组要低于对照组,但没有统计学差异;(3)Meta分析的随机效应模型对MTT敏感组和对照组间的综合生存率与病死率比较好后发现,前组的综合生存率与病死率都要优于后组(P0.01),同时III期患者中接受基于MTT药敏实验数据化疗的患者无论在综合生存率还是病死率都要优于对照组患者(P0.01),而对IV期患者的分析结果则表明只有综合生存率要优于对照组患者(P0.05),而病死率未见有统计学差异(P0.05)。研究结论:Meta分析的结果表明MTT体外肿瘤药敏实验能够对胃癌的临床化疗用药的选择提供参考依据,进而可以提高胃癌患者的综合生存率,降低病死率,上述结论与我们的回顾性分析存在一定的偏倚,由于还缺乏MTT体外肿瘤药敏实验与胃癌疗效间的关系的大规模多中心的临床研究证据,要最终确证MTT体外肿瘤药敏实验的临床价值,需要更多的研究来证实。