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一种抗菌多肽的毕赤酵母表达的初步研究

孙睿华  
【摘要】: 上海高科联合生物技术有限公司设计合成的抗菌肽GK8具有良好的杀菌活性,前期已人工合成了一定量的纯品,同时对GK系列抗菌肽也进行了大肠杆菌的融合表达。这为本文开展GK8毕赤酵母表达系统的研究创造了条件。选用的巴氏毕赤酵母不但具有原核生物易培养、操作便利等特点,又具有真核生物蛋白翻译后加工的能力;同时具有高表达、高稳定和高分泌等优点。其表达质粒属于分泌型,便于提取和纯化。 本研究在由上海生工生物工程有限公司订购的质粒pUC57-GK8和设计的引物P1、P2的基础上,以pUC57-GK8质粒DNA为模板,通过PCR扩增鉴定该质粒的可靠性。将含有pUC57-GK8质粒大肠杆菌DH5α进行大量表达。经质粒提取、酶切鉴定筛选出阳性克隆用于构建重组质粒pPIC9K-GK8。重组质粒pPIC9K-GK8电转化到毕赤酵母中,通过G418筛选和双酶切鉴定选择转化了pPIC9K-GK8的毕赤酵母菌株进行诱导表达,收集毕赤酵母分泌表达的目标产物GK8。通过SDS-PAGE电泳和对金黄色葡萄球菌的杀菌活性初步检测,筛选高表达菌株。对有较高目标产物GK8表达的转化pPIC9K-GK8的毕赤酵母菌株进行扩增表达,并对发酵液进行了纯化分析和生物学活性检测。 实验结果显示有目标产物GK8表达。通过纯化使其纯度大于95%。表达产物GK8的生物学活性和人工合成GK8相似,明显优于Cecropin。以上工作为进一步筛选高表达菌株,摸索大规模发酵及纯化工艺打下了一定基础。


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