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微米级亲和凝胶载体的制备及其亲和吸附蛋白质研究

唐雪珍  
【摘要】:作为一种重要的生物活性大分子分离纯化技术,亲和吸附已广泛应用于生化、医药等领域。亲和纯化技术的关键之一是制备出高特异性的亲和微载体。微载体的粒度越小、越均一,其表面可以偶联的特异性亲和配基越多,载体的饱和吸附容量越大;亲和微载体的专一性越高,则目标分子的活性回收率和纯化倍数就越高。传统亲和吸附采用固定床吸附,压降大易造成介质变形,而且生产规模受到限制。本研究采用间歇亲和吸附方法,将亲和载体悬浮分散于蛋白质溶液中,通过吸附、脱附从而得到高纯度高活性的目标蛋白,该方法简单易行,亲和载体吸附重复性好,为进一步研究连续亲和吸附过程提供了基础数据。 目前应用于生化分离的琼脂糖凝胶粒径分布大部分为200-300μm,小粒径单分散的微球可以保证亲和载体具有较大的比表面积,大的吸附量;但微球与目标蛋白位点之间吸附时存在空间位阻,需键和一定长度和性质的间隔臂,本研究旨采用丝氨酸类特异性配基对氨基苯甲脒为配基,以胰蛋白酶模拟体系考察高特异性亲和载体的制备路线,主要研究内容及结论如下: 1.建立了亲和微载体的制备工艺路线 以进口Sepharose CL-6B为微载体,经碱液预处理、环氧氯丙烷活化后,键和间隔、臂分子氨基己酸,于水溶性碳二亚胺溶液中偶联特异性配基对氨基苯甲脒(P-ABZ),乙醇胺掩蔽其他剩余基团电荷,成功制得了高特异性的亲和微载体。 2.间歇亲和吸附研究及吸附模型 以胰蛋白酶为目标蛋白,30℃时,于pH7.9磷酸盐吸附缓冲溶液中振荡吸附1h;以KCl溶液(0.01M乙酸)为洗脱液连续洗脱三次,亲和载体吸附量为33.3mg/g,活性回收率为83.7%,纯化倍数为7.37。研究表明胰蛋白酶亲和吸附过程符合Langmuir吸附等温方程,可表示为:该亲和载体对牛血清白蛋白吸附量为0.3mg/g,仅为胰蛋白酶吸附量的0.75%,表明其吸附专一性高。 3.琼脂糖-葡聚糖复合亲和微载体吸附胰蛋白酶 采用反相悬浮法制备了琼脂糖-葡聚糖复合亲和凝胶载体,并将其制备成高特异性亲和微载体。复合亲和载体的胰蛋白酶吸附量为30.80mg/g,纯化倍数为6.88,活性回收率为88.70%,胰蛋白酶活性由1000BAEE/mg提高到6880BAEE/mg;该复合亲和微载体具有较好的机械性和重复稳定性,为实现蛋白质连续化规模化生产建立了基础。


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