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微生物脂肪酶基因的克隆与表达

吴娇娇  
【摘要】:本文通过分子生物学手段克隆了粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens) ECU1010脂肪酶新基因lipB,并对其进行了可溶性表达优化,研究了该重组脂肪酶的发酵、纯化手段与相关酶学性质。此外,本文克隆了7个棒曲霉脂肪酶基因,并实现了其在大肠杆菌中的高效表达,这将有利于具有工业应用价值的脂肪酶的筛选和发现。 通过PCR克隆粘质沙雷氏菌脂肪酶新基因lipB。该基因长为1845bp,编码614个氨基酸(Genbank登录号:HM440338)。以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌株,pET-28a(+)为表达载体,对粘质沙雷氏菌脂肪酶基因lipB进行了表达。在摇瓶中对重组菌进行了表达优化。考察了温度、IPTG浓度、培养基中Ca2+浓度对重组脂酶可溶性表达的影响,发现Ca2+为重组菌产酶的的限制性因素之一,通过低温(15℃)可以显著提高脂肪酶的可溶性表达,经过优化可溶性酶的活性可高达153720 U/L。 在摇瓶培养的基础上,用5L发酵罐对菌体进行培养。发酵培养基:蛋白胨10g/L,酵母粉10 g/L,NaCl 10 g/L,NH4C12 g/L,K2HPO4 8 g/L, KH2PO4 4g/L, MgCl2 1g/L用10M NaOH调pH至7.0。补料培养基:碳源:30%葡萄糖1 L;氮源:30%酵母粉400ml。诱导同时加入5 mmol/L的Ca2+能提高表达产物的活性。粘质沙雷氏菌脂肪酶LipB经发酵后菌体湿重达到245g。 对LipB的纯化手段进行了研究和比较,通过硫酸铵沉淀和FPLC的方法进行纯化并获得了很好的纯化效果,接着对脂酶粗酶进行了酶学性质研究。考察了重组脂酶的最适反应pH、pH稳定性、温度稳定性,金属离子对酶活的影响,以及脂酶对有机溶剂的耐受性等酶学特性。结果表明LipB最适反应温度为40℃,最适pH为8.5。该酶能在pH 5-7条件下保持稳定,Ca2+对酶活有促进作用。与已报道的粘质沙雷氏菌ECU1010脂肪酶LipA相比,LipB对不同有机溶剂的耐受性有明显差异。通过基于SWISS-MODEL的同源建模分析三维结构,第33位氨基酸的改变(D33G)对两者性质的不同起了很大的影响。 论文中对棒曲霉脂肪酶进行了研究,尝试用不同方法抽提棒曲霉基因组DNA,根据Genbank上报道的棒曲霉脂肪酶基因序列,设计引物,克隆了7个棒曲霉脂肪酶基因,并实现了其在大肠杆菌中的高效表达,为进一步对棒曲霉脂肪酶结构与功能研究及新用途的开发奠定了基础。


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