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从鱼到人:主要病原性弧菌的致病机理研究

芮浩鹏  
【摘要】:在海洋环境中,大多数的弧菌是最常见的细菌类群,它们维持着正常的海洋生态环境,但是某些弧菌却对人类和海水动物有害。本课题分别对海水养殖鱼类的致病细菌溶藻弧菌进行了群体感应系统以及调控的致病因子研究,在新生幼兔模型上对人源性病原菌霍乱弧菌进行了减毒活疫苗副作用机制的研究以及在新生幼兔模型上对重要食源性致病菌副溶血弧菌进行了致病机理研究。 溶藻弧菌是我国南方海水养殖中重要的病原菌,但是其主要的致病因子和致病机理仍然未知。本课题发现了溶藻弧菌具有与哈维氏弧菌相似的群体感应系统,并对其中枢调控因子LuxRval进行了功能研究。luxRval基因的表达呈细胞密度依赖型,在低密度时luxRval基因的表达量很低,在高密度时luxRval基因大量表达。溶藻弧菌LuxRval蛋白调控多种生理功能,对胞外多糖和胞外蛋白酶的合成具有正调控作用,对运动性则具有负调控作用。我们发现LuxRval蛋白对溶藻弧菌分泌的碱性丝氨酸蛋白酶Asp具有调控作用。碱性丝氨酸蛋白酶Asp在生长对数末期(细菌高密度)表达,luxRval基因的缺失会导致Asp的表达量大大降低。通过对碱性丝氨酸蛋白酶Asp的基因功能研究,证明Asp是溶藻弧菌分泌的最主要胞外蛋白酶,是溶藻弧菌感染斑马鱼的一个重要毒力因子。asp基因缺失导致溶藻弧菌感染斑马鱼的半致死剂量提高15倍,并且对鲤鱼上皮瘤细胞的细胞毒性作用减弱。 霍乱是由霍乱弧菌引起的一种古老的传染病,疫苗是防治霍乱的一种有效的方式。霍乱减毒活疫苗具有较好的免疫效果,但是通常也伴随有比较大的副作用。本课题应用新生幼兔动物模型对霍乱减毒活疫苗副作用机制进行研究。我们发现,霍乱毒素缺失菌株Peru-NT能够感染幼兔,并在小肠内克隆繁殖,幼兔通常会有轻度至中度的腹泻现象。霍乱弧菌鞭毛是造成疫苗副作用最主要的原因,因为幼兔在受霍乱弧菌鞭毛蛋白缺失株ΔflaABCDE感染后,90%的幼兔不再出现腹泻现象。我们证明了霍乱弧菌鞭毛蛋白是疫苗副作用的产生原因,而非游动性和鞭毛结构。霍乱弧菌的所有5个鞭毛蛋白FlaA、FlaB、FlaC、FlaD和FlaE都对疫苗副作用具有贡献,在敲除其中一个或者几个鞭毛蛋白后,仍能导致幼兔产生腹泻。幼兔腹泻现象与野生型和鞭毛突变株在肠道内的克隆繁殖和定位差异无关。与野生型相比,幼兔在受鞭毛蛋白缺失株ΔflaABCDE感染后,先天免疫反应降低,许多促炎症细胞因子的mRNA表达量降低。因此,我们认为鞭毛蛋白导致腹泻现象主要与其介导的先天免疫反应相关,过强或者异常的肠道免疫反应,可能导致宿主出现腹泻现象。这些试验结果为霍乱减毒活疫苗的开发提供了新的策略。 副溶血弧菌是一种重要的食源性致病菌。目前对副溶血弧菌致病机理不清楚,主要原因是没有合适的动物模型可以用来研究其致病机理。我们开发了动物模型(新生幼兔)来研究副溶血弧菌致病机理。口服含有副溶血弧菌的溶液后,87%的新生幼兔受感染,出现腹泻现象。一般来说,幼兔在被感染30 h左右出现腹泻现象,但是,不同幼兔出现腹泻现象的时间会有差异。在解剖新生幼兔时也发现其肠道内有很多液体积累。我们发现,位于小染色体上的第二套三型分泌系统(T3SS2)是副溶血弧菌的主要致病因子,缺失T3SS2后的副溶血弧菌基本丧失了在幼兔肠道内的克隆繁殖能力,幼兔不会出现腹泻现象,肠道内也没有液体的积累。而溶血素TDH和大染色体上的第一套三型分泌系统(T3SS1)与副溶血弧菌对幼兔的致病无关。用荧光定量PCR检测幼兔肠道内不同促炎症细胞因子(IL-6,IL-8,TNF-α,IL-1β)的表达水平时,发现野生型、T3SS1和tdh突变株感染的幼兔体内的促炎症细胞因子的表达水平比被T3SS2突变株感染时高很多倍。组织病理学研究表明,野生型、tdh和T3SS1突变株的感染导致幼兔小肠中端至末端出现细胞增殖、细胞脱落、组织充血、中性粒细胞聚集、水肿、肠道绒毛缩短等严重病理现象,而T3SS2突变株不会对幼兔小肠造成明显的病理现象,基本与缓冲液处理的幼兔一样。最后,荧光共聚焦显微镜实验观察到副溶血弧菌会在肠道形成微菌落,通常零散地分布于肠道绒毛壁和肠道空腔。


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