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抗菌肽Cecropin P1在毕赤酵母中的表达与活性研究

陈婉娴  
【摘要】:本课题系863项目“饲料用抗菌肽的分子改良和产品研制”的子课题。 传统抗生素的长期广泛使用导致病原菌的抗药性问题及其在畜牧产品中残留问题已严重威胁着人类的健康。因此,开发一种高效、安全的抗生素替代品成为饲料添加剂研究的重要方向,而具有抗微生物等多种生物学功能的抗菌肽显示出广阔的应用潜力。 Cecropin P1是一种分离自猪小肠的抗菌肽,属于天蚕素家族成员之一,含31个氨基酸残基,对革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌具有抑菌活性。本课题旨在利用基因工程技术实现抗菌肽Cecropin P1在毕赤酵母中的高效表达,为抗菌肽Cecropin P1生产工艺的研发及其它抗菌肽的研究开发奠定理论与实践基础。 本课题依据毕赤酵母的密码子偏爱性,采用重叠区基因扩增拼接法,按照CecropinP1的氨基酸序列设计合成其编码基因。为实现Cecropin P1在毕赤酵母中的高效、活性表达,设计了两个C-末端序列不同的表达盒:一是末端添加终止密码子,二是融合了C-myc蛋白和六聚组氨酸标签序列。利用同源重组技术,以穿梭质粒pPICZaB与pGAPZaA为载体,分别构建得到pPICZaB-Cecropin P1-1 pPICZaB-Cecropin P1-2、pGAPZaA-Cecropin P1-1和pGAPZaA-Cecropin p1-2四个表达质粒,经电转整合至毕赤酵母基因组DNA上,通过拷贝数和表型筛选,得到了四个毕赤酵母整合子pPICZaB-Cecropin P1-1/X-33、pPICZaB-Cecropin PI-2/X-33、pGAPZaA-CecropinP1-1/X-33和pGAPZaA-Cecropin PI-2/X-33,摇瓶发酵结果显示,最佳收获时间分别为36h、48h、36h和72h,重组抗菌肽产量分别为8.53mg/L、3.48mg/L、8.8mg/L以及0.95mg/L,表明pGAPZaA-Cecropin P1-1/X-33的表达量最高。经薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测活表明,天然C-末端的Cecropin P1具有抑菌活性,而C-端融合了C-myc蛋白和六聚组氨酸标签的Cecropin P1不具有抑菌活性,从而证明Cecropin P1的C-末端序列对其功能有重要影响。


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