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基于液相色谱质谱联用技术的磷脂组学平台的建立、改进及应用

朱超  
【摘要】:为了实现生物体内所有代谢物的定性定量分析,代谢组学正沿着“整合化”方向不断发展。对具有不同理化性质的各类化合物的分析检测要求不同的技术平台。因此,针对不同类别化合物分别建立定性定量方法,然后整合分析所得数据,是实现全面检测生物体内代谢物的一种有效手段。稳定可靠的检测方法是代谢组学研究的关键前提。 磷脂是细胞膜的重要组成部分,具有非常重要的生理功能,与人类健康和多种疾病的发生发展有着密切关系。有必要针对磷脂化合物建立一种高效的分析检测平台,对磷脂及其代谢与疾病的关系进行深入研究。本文采用液相色谱质谱联用技术(LC-MS),结合质谱数据的多元统计分析(MVA),建立了磷脂组学平台,并实现了平台的改进及应用。 1.基于正相色谱飞行时间质谱(NPLC-TOF/MS)和离子阱质谱(Ion trap/MS)技术,初步建立了磷脂组学平台并将其应用于糖尿病与糖尿病肾病的研究中。采用二醇基色谱柱和正己烷/异丙醇/水流动相等度洗脱,在45 min内实现了7大类磷脂65种化合物的同时定性定量分析。利用该平台,我们研究了中药方剂“糖肾方”对自发性Ⅱ型糖尿病鼠磷脂代谢的影响,发现糖肾方能够调节糖尿病鼠磷脂代谢,并筛选出8种磷脂化合物作为糖尿病相关的潜在生物标志物。通过对糖尿病患者和糖尿病肾病患者的磷脂组学研究,偏最小二乘显著性分析(PLS-DA)聚类结果显示糖尿病、糖肾病患者和健康人之间存在磷脂代谢差异。通过PLS-DA和方差分析(ANOVA)筛查出3种糖尿病专属标志物,8种糖肾病专属标志物,另外还发现了2种新的磷脂标志物,可以用来区分糖尿病患者、糖肾患者和正常人。最后,利用外标法确定了此两种生物标志物在各类群体中的血浆浓度范围。 2.针对初步建立的磷脂组学平台所存在的缺陷,如:样本用量高、分析时间长、保留时间飘移、无内标校正定量等,利用亲水作用色谱离子阱傅立叶转换质谱联用技术(HILIC-Ion trap-FT/MS)对原有磷脂组学平台进行了改进。首次建立了基于亲水作用色谱质谱联用技术的磷脂分离检测新方法。采用异丙醇法提取血浆中的磷脂,大大简化了样本前处理,只需10μL的血浆样本用量。采用二醇基色谱柱和乙腈/水流动相梯度洗脱,在15 min内可分离鉴定9类磷脂中的186种化合物,大大提高了检测通量和检测范围。利用此方法成功分离了不同生物样本的磷脂提取物。该方法通过了规范化的代谢组学方法学验证,证明其能够应用于血浆和肝脏组织的磷脂定性定量检测。改进后的磷脂组学平台具有简便性、高效性、稳定性和规范性等特点。 3.将改进后的磷脂组学平台应用于中枢神经系统(CNS)障碍引起的磷脂代谢紊乱的研究。通过对实验性自身免疫性脑炎(EAE)大鼠模型的研究,发现了血浆磷脂代谢紊乱与多发性硬化症密切相关,并找出多发性硬化症早期的生物标志物。整合分析血浆磷脂组学数据和脑脊液代谢组学数据,发现了大鼠血浆磷脂和脑脊液所反映的代谢状况存在一定程度上的一致性。这一研究为神经中枢系统障碍的血浆代谢组学研究提供了可参考依据。 本研究为代谢组学的整合化发展提供了一个简便快捷、稳定可靠、高通量的分支平台一磷脂组学平台。


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