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功能性纳米粒子的制备及其与蛋白质的相互作用研究

陈凯敏  
【摘要】:纳米科技和生物技术是当今科学领域的研究热点。功能化的纳米粒子在生物领域,如蛋白分离、靶向给药、药物控释等方面有着巨大的潜在应用。纳米粒子与生物活性物质间的相互作用会随着环境的改变而发生变化。通过对纳米粒子进行有效的功能化,可以实现对纳米粒子与生物活性物质之间相互作用的调控,从而为其后续的应用奠定理论基础。 本文主要合成了两种不同类型的功能化纳米粒子(金纳米粒子和磁性球形聚电解质刷),并研究了其与蛋白质(牛血清蛋白和β乳球蛋白)之间的相互作用。金纳米粒子与蛋白质的相互作用研究为制作生物传感器提供了理论基础,球形聚电解质刷与蛋白质的相互作用研究可以用来对不同蛋白质进行分离,而磁性纳米粒子的引入不仅可以提高蛋白分离的效率和速率,还可以利用外磁场实现球形聚电解质刷的磁分离回收和再利用。本工作的具体内容如下: 1.利用Brust-Schiffrin相转移法和Murray配体交换的方法,制备得到水溶性极佳的金纳米粒子。金纳米粒子表面的配体是含有不同疏水性端基的季铵盐。TEM表征表明得到的金核直径约2 nm,动态光散射(DLS)表明得到的配体修饰的金纳米粒子的直径为8-13 nm。用共沉淀的方法制备了直径为10 nm左右的四氧化三铁磁性纳米粒子。发现以丙酮作为油酸的助溶剂,在反应前加入油酸,得到的磁性纳米粒子在苯乙烯中的分散性最好。最佳的油酸含量约为25 wt%。接着用细乳液聚合的方法制备了磁性聚苯乙烯核,最后用光乳液聚合的方法制备得到比较理想的磁性球形聚电解质刷。 2.选择牛血清蛋白(BSA)和β乳球蛋白(BLG)两种等电点相似的蛋白质来研究金纳米粒子对它们的选择性。金纳米粒子表面采用端基为四乙二醇三甲基铵(TTMA)的配体进行修饰,以消除金纳米粒子配体端基结构中氢键和疏水基团的影响。研究方法包括:高分辨浊度滴定(high-resolution turbidimetry)和动态光散射(DLS)。结果表明,TTMA修饰的金纳米粒子与BSA结合之后立即形成不可溶的聚集体,而TTMA修饰的金纳米粒子与BLG结合时首先形成可溶性的复合物,然后才形成不可溶的聚集体。我们用DelPhi软件模拟了BSA和BLG在临界pH值附近的表面静电势分布,发现BSA具有离散的电荷补丁,而BLG具有类似偶极的正负电荷补丁。不同表面电荷分布导致的不同电荷补丁类型,可以用来解释BSA和BLG与TTMA修饰的金纳米粒子之间相互作用的差异。为了排除蛋白质自身结构中氢键和疏水基团对选择性的影响,选择了BLG蛋白质的两种变体BLGA和BLGB,来研究与TTMA修饰的金纳米粒子之间相互作用的差异。 3. BLGA和BLGB单体之间只有两个氨基酸不同。BLGA的64位是天冬氨酸,118位是缬氨酸,BLGB的64位是甘氨酸,118位是丙氨酸。研究结果表明TTMA修饰的金纳米粒子对这两种蛋白质变体的选择性非常高,在离子强度为5 mM的时候,临界pH值相差0.65个单位。远远高于聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDADMAC)对BLGA/BLGB的选择性(临界pH值相差0.20个单位)。据此,我们首次提出了“静电选择性”的机理,即通过调控静电相互作用力,来选择性地与不同蛋白质发生相互作用。我们用等温滴定量热法(ITC)研究了TTMA修饰的金纳米粒子与BLGA/BLGB发生结合时的热力学参数。结果表明,BLGA与TTMA修饰的金纳米粒子结合的化学计量比和结合常数都要比BLGB大。另外,TTMA修饰的金纳米粒子与BLGA/BLGB结合焓变是正值,说明整个结合过程是熵驱动的。最后我们用ITC的方法,研究了其它类型季铵盐配体修饰的金纳米粒子,与BLGA/BLGB结合过程中热力学参数的变化。发现疏水基团的引入,影响了金纳米粒子对BLGA/BLGB的选择性。当疏水作用较小时,静电力起主导作用,选择性(结合常数差异)由BLGA与BLGB之间的负电荷补丁决定;当疏水值较大时,疏水作用占主导,金纳米粒子对BLGA/BLGB的选择性几乎消失;而当疏水值适中时,静电力和疏水作用的协同作用使金纳米粒子对BLGA/BLGB的选择性达最高。 4.使用偶氮二异丁腈(AIBN)作为引发剂,最高磁含量只有15 wt%左右,而且实际磁含量远小于理论磁含量。使用过硫酸钾(KPS)作为引发剂,并辅助于磁性纳米粒子聚集体,最高磁含量可达到52.3 wt%,并且实际磁含量高于理论值。可能的原因是磁性纳米粒子降低了苯乙烯的单体转化率,使实际磁含量大大提高。使用偶氮二异丁腈(AIBN)作为引发剂,磁性纳米粒子在聚苯乙烯基体中的分布不均匀,部分磁性纳米粒子直接暴露在聚苯乙烯核的表面。改为KPS作为引发剂的时候,磁性纳米粒子在聚苯乙烯核内的分布明显改善,磁性纳米粒子主要分布在核中心区域。我们提出的聚合机理是:使用AIBN引发剂,聚合由苯乙烯单体液滴的内部向外部推进,把磁性纳米粒子“推挤”到核的外部甚至外表面;在使用KPS的时候,聚合是从苯乙烯单体液滴的外面向内部进行,磁性纳米粒子被“挤压”到聚苯乙烯核的内部。因为聚丙烯酸链之间存在静电斥力和空间位阻,磁性球形聚电解质刷的稳定性明显好于磁性聚苯乙烯核。磁性球形聚电解质刷在室温下可以稳定好几个月。磁性球形聚电解质刷在强磁作用下能够进行快速磁分离,并且可以在水中进行再分散。多次磁分离-再分散之后,尺寸仍保持不变,具有良好的再分散性。磁分离的效率和速率可以通过调节磁含量和pH值来实现。最后,我们通过浊度滴定和DLS的表征,研究了球形聚丙烯酸刷与BSA和BLG两种蛋白质的相互作用。发现在一定的pH值范围内,可以根据球形聚电解质刷与这两种蛋白质吸附量的不同进行分离。


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