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耐有机溶剂脂肪酶的筛选、重组表达及其催化特性研究

彭仁  
【摘要】:脂肪酶(lipase,EC3.1.1.3)是普遍存在于自然界中的酶,它被广泛地运用于精细化工、洗涤、医药、食品、造纸、皮革加工、纺织和饲料工业等领域。从催化特性来看,脂肪酶具有高度的区域选择性和立体异构选择性,且反应不需要辅酶、反应条件温和、副产物少。脂肪酶的另一显著特点是它能在异相系统(即油-水界面)或有机相中作用。在水相中,脂肪酶通常催化水解反应的进行,而在有机相中,它却能催化各种合成反应:如酯化、酯的醇解、酯的氨解和酯的酸解等。然而有机溶剂会使酶变性或使酶活力下降,因此寻找耐有机溶剂的脂肪酶,使其在有机溶剂或含有机溶剂的环境中具有较高的催化活性,已成为脂肪酶研究领域的一个重要方向。本论文从自然界中成功筛选到产耐有机溶剂脂肪酶的菌株,对其产酶条件进行了研究,此外提纯和表征了该酶,并克隆和共表达了该脂肪酶及其折叠酶基因,最后用固定化的重组CS-2脂肪酶催化催化合成了乙酸丁酯。 论文内容分为五部分。 第一部分:产耐有机溶剂脂肪酶的菌株的筛选和鉴定。通过富集培养、粗筛和复筛,得到一株产耐有机溶剂脂肪酶的菌株CS-2。其产酶活性为1.63 U/ml,它在25%(v/v)的甲苯中30℃下孵育30 min后残余酶活力达95.7%。菌株CS-2的菌落为圆形、有光泽、乳黄色。菌株形状为杆状,革兰氏阴性,不产芽孢,具夹膜,单端生鞭毛。在25℃、37℃、45℃均能生长。不产脲酶,不产H2S,能利用柠檬酸盐、D-乳糖、D-果糖、D-葡萄糖、甘露醇和甘油,但不能利用D-麦芽糖和蔗糖。能水解明胶、干酪素和吐温-80,但不能水解淀粉。菌株CS-2的16SrDNA基因序列长度为1499bp,在Genbank的序列登录号为GQ254065。根据菌株CS-2的形态特征、生理生化特征和16SrDNA序列分析,菌株CS-2命名为Pseudomonas aeruginosa CS-2。来自Pseudomonas aeruginosa CS-2的粗脂肪酶在有机溶剂中表现出一定的稳定性。 第二部分:产酶条件的研究。Pseudomonas aeruginosa CS-2发酵24 h后,其生长达到最大,然后缓慢下降。脂肪酶的活性在18 h后快速增加,48 h时产酶活力最高。有机氮源比无机氮源对产脂肪酶更有利,其中蛋白胨和胰蛋白胨为氮源时产脂肪酶最高。阿拉伯胶、吐温-20、吐温-80、聚乙烯醇124能促进脂肪酶的产生,而CTAB和Triton X-100则起相反的作用。培养温度37℃为产脂肪酶的最佳温度,转速200r/min为产脂肪酶的最佳转速,初始pH 7.5为产脂肪酶的最佳pH。 第三部分:建立了P. aeruginosa CS-2所产胞外脂肪酶的纯化过程,并对纯化的脂肪酶进行表征。经过超滤、有机溶剂沉淀和离子交换层析等步骤,获得了电泳纯的脂肪酶,纯化倍数达到25.5倍,总活力回收率为45.5%。SDS-PAGE和凝胶过滤法测得的该酶的分子量约为33.9 kDa和36 kDa,因此该脂肪酶为单一亚基。该脂肪酶的C端序列为KNASLWDPGRG,与NCBI蛋白质数据库中现有脂肪酶的C端序列无一致性。该酶催化的最适温度为50℃,在40-70℃范围内趋于稳定,能达到最大酶活的80%以上。CS-2脂肪酶热稳定性较高,在80℃处理30min后残余酶活力为62.7%。该酶最适作用pH值为8.0,在pH为7.0-9.0范围内趋于平稳,该酶在较宽的pH(4.0-10.0)范围内稳定性较高,孵育30min后,残留酶活力仍在80%以上,因此它属于碱性脂肪酶。Ca2+对酶有激活作用,其它测定的金属离子对酶则起抑制作用,并且激活或抑制作用强弱与金属离子浓度有关。CTAB、Tween20、Tween80和Triton X-100对CS-2脂肪酶有抑制作用,而阿拉伯胶和聚乙烯醇-124有激活作用。在不同链长的对硝基苯酚酯中,CS-2脂肪酶的最佳底物为对硝基苯酚棕榈酰酯。CS-2脂肪酶在乙腈中活性提高,在DMSO和一些非亲水有机溶剂中具有一定的稳定性。 在第四部分:CS-2脂肪酶及其折叠酶基因的克隆和表达。CS-2脂肪酶及其折叠酶基因的序列长度为2025bp,其中CS-2脂肪酶基因不含有终止密码子。CS-2脂肪酶及其折叠酶基因在E. coli BL21(DE3)进行共表达,重组的CS-2脂肪酶在细胞中能以具有活性的可溶蛋白形式存在。据我们所知,不含有终止密码子的基因能够在细胞中以活性形式进行表达还未见报道。经亲和层析纯化后的脂肪酶活性为203.8U/mg,其中纯化倍数为10.2,得率为40.9%。亲和层析纯化后的酶在SDS-PAGE中显示两条明显的条带,分子量约为35.7kDa和38.3 kDa。CS-2脂肪酶基因的可溶性表达需要折叠酶基因共表达进行辅助。 在第五部分:固定化的重组CS-2脂肪酶在正庚烷中催化合成乙酸丁酯。催化的最适反应条件如下:反应时间10h,水分活度0.02,反应温度为55℃,乙酸和正丁醇浓度分别为0.1mol/L和0.2mol/L,在反应8h时加入0.5g 4A分子筛作为吸水剂。在该优化条件下,底物转化率达到了98.2%,并且该固定化酶使用5次,底物转化率仅从98.2%降低到87.4%。因此该固定化酶催化合成乙酸丁酯时表现出较高的催化能力和良好的重复使用性。


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