一种新型的NADH荧光探针

【摘要】：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)及其还原型(NADH)是生物体中广泛存在的辅酶。由于NADH在代谢和信号转导中的中心作用及其在疾病诊疗中的重要性,对组织与细胞内NADH的分布及动态变化进行生物成像将为相关研究提供重要的信息。但长期以来应用的NADH自发荧光成像的方法由于无法区分NADH与NADPH这两种不同的功能分子而存在重大缺陷,严重制约了相关研究的发展。本论文基于分子结构理性设计与蛋白质工程方法,利用对NADH特异性响应的ydiH蛋白与黄色荧光蛋白融合,构建了在NADH结合后荧光性质发生改变的荧光蛋白探针Perex。通过理性设计与定点突变的方法对Perex探针进行了改造与筛选,以提高Perex探针的对NADH的响应并降低其核苷酸的非特异性结合,最终得到了两个在不同浓度范围内灵敏、特异性响应NADH的Perex探针。本论文详细研究了物理及化学环境,pH、温度、以及其它吡啶核苷酸盐及类似物,对Perex系列探针的荧光性质,对探针的影响.。细胞生物学实验显示,该系列探针能在活细胞内表达并定位于亚细胞结构,指示生理浓度的NADH变化。本论文研究所得到的Perex探针将可用于建立监测NADH在活体、组织、细胞甚至亚细胞结构中分布的高时空分辨成像技术,可为对细胞生物学、生理学等生命科学基础研究及生物工程、代谢工程等应用基础领域提供有力研究工具。