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重组金黄色葡萄球菌蛋白A的制备性质研究与应用

唐秀  
【摘要】:金黄色葡萄球菌蛋白A (Staphylococcal protein A, SPA)是存在于大多数金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)细胞壁上的一种蛋白。蛋白A是单一多肽链,分子中无色氨酸(Trp),有高度类似的Fc结合位点。本文以金黄色葡萄球菌的基因组为模板,成功构建了蛋白A的重组表达菌株,并筛选出了表达量较高的克隆SPA30。此外,还成功构建出SPA30的截短体SPA25以及大分子蛋白SPA45。 本文通过实验研究了不同分子量大小的蛋白A的性质,如耐酸性、耐碱性和耐高温性,并根据其性质差异确定了不同蛋白的纯化条件,最终得到了纯度高达97%的目的蛋白。SPA25对0.25 M的HCl耐受性较好;经0.5 M HCl处理30min时蛋白仅稍有降解。重组SPA30菌株用0.2 M HCl处理0.5~1 h时,杂质较少,目的蛋白较纯;在0.5 M HCl中处理1h无明显变化。SPA45在0.5 M HCl中处理1 h,蛋白无降解,耐酸性较好。 SPA25重组菌经0.5 M NaOH处理40 min后无明显变化。用不高于0.2 M的NaOH裂解重组菌SPA301 h,得到的目的蛋白SPA30较纯。SPA45对0.25 MNaOH的耐受性较好。 SPA25在4-70℃的温度下放置6h,蛋白稳定性较好。SPA45在常温下稳定性不如SPA25。SPA30在4℃时放置过夜后蛋白稍有降解,常温下极易降解。 在蛋白A的应用研究方面,以环氧氯丙烷(ECH)为活化剂,通过正交试验确定了琼脂糖凝胶的最佳活化条件:ECH浓度20%(v/v),NaOH浓度0.8 M,加入体积1 ml,活化时间2.5 h,反应温度40℃。进行基团偶联实验时发现在pH6.4~8.0的条件下-SH均可偶联到活化胶上;在pH 10~11时,-NH2可偶联。蛋白A作配基偶联活化后的Sepharose 4FF可用于纯化兔免疫蛋白IgG。


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