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PEG修饰人犬嵌合尿酸酶结构功能研究及临床前药理学评价

张淳  
【摘要】:尿酸酶[EC 1.7.3.3]是嘌呤代谢过程中的一种酶,它可将尿酸水解为更易溶于水的尿囊素。人类由于基因突变而缺乏活性尿酸酶,这导致人类以尿酸作为嘌呤代谢的终产物。当人血液中尿酸浓度高于其溶解度(高尿酸血症)时可引起尿酸性肾病和痛风性关节炎。天然(UricozymeTM)和重组(ElitekTM)的Aspergillus flavus来源尿酸酶已被用于急性高尿酸血症的治疗,但是这种微生物来源尿酸酶的强免疫原性和短半衰期限制了他们对慢性高尿酸血症及痛风的治疗。PEG修饰可降低尿酸酶的免疫原性并延长其体内半衰期,因此人们从1981年即已开展PEG修饰尿酸酶的临床前研究,但是到目前为止只有一个PEG修饰尿酸酶类药物上市(KrystexxaTM)。然而,Krystexxa的临床前研究表明92%的病人产生了特异性抗体而且57%的病人多次注射Krystexxa后出现了体内降低尿酸效果减弱的现象,此外这个由10kDa mPEG修饰的类似猪源尿酸酶只能用于静脉推注。据我们所知,到目前为止还没有免疫原性更低的注射途径更方便的PEG修饰尿酸酶药物上市。 本课题首先以犬源尿酸酶为基础筛选得到了同源性、活性、四聚体稳定性和回收率更高的人犬嵌合尿酸酶;利用特制的5 kDa mPEG-SPA修饰剂对高纯度重组四聚体人犬嵌合尿酸酶进行饱和修饰,并对修饰后人犬嵌合尿酸酶蛋白的临床前药理学性质和安全性进行了初步评价。 第一部分:人犬嵌合尿酸酶的构建、筛选和结构功能研究 鉴于犬源尿酸酶较高的催化活性及其与推测出的人源尿酸酶的高同源性,首先在大肠杆菌中重组表达制备了犬源尿酸酶。以此为基础构建了5个人犬嵌合尿酸酶,并对其基本性质进行了研究。最终筛选到的人犬嵌合尿酸酶与初始犬源尿酸酶相比,活性和稳定性均有显著提高。以最优的人犬嵌合尿酸酶为基础进行了同源建模并对与活性和稳定性相关的关键氨基酸区域进行了研究:哺乳动物尿酸酶C末端的291-304位氨基酸对于维持蛋白的活性和稳定性至关重要,而位于H4区域下半部分和S7区域上半部分的245-253位氨基酸与四聚体尿酸酶蛋白的回收率和稳定性有关。同时,利用分子对接和分子动力学模拟等方法确认了人犬嵌合尿酸酶的活性中心,扩宽了一个新颖的氧气结合位点的氨基酸构成,并首次确认了活性中心附近的高度保守氨基酸的功能。利用质量肽图确认了人犬嵌合尿酸酶的氨基酸序列,并结合SE-HPLC和亲和层析的方法首次确认了尿酸酶家族蛋白中广泛存在的与二硫键无关的活性共价二聚体的构成形式。利用封闭游离半胱氨酸、胰蛋白酶酶切和液质联用的方法确认了哺乳动物尿酸酶中序列高度保守的4个半胱氨酸残基的构成形式并对其功能进行了分析。 第二部分:开发免疫原性足够低的PEG修饰哺乳动物尿酸酶 首先成功纯化并鉴定了四聚体和多聚体尿酸酶蛋白。在接下来的PEG修饰中,利用阴离子交换层析的方法除掉了PEG修饰剂中的PEG Diol,并将四聚体尿酸酶和多聚体尿酸酶分别与除掉PEG Diol前后的5kDa mPEG-SPA修饰剂进行反应,制备了三种不同形式的PEG修饰尿酸酶。尿酸酶多聚体可以降低PEG修饰后蛋白的酶活保留率,除去该多聚体后可消除这种影响,且四聚体尿酸酶修饰后酶活保留率可大于85%。动态光散射系统和透射电镜技术首次成功用于分析不同PEG修饰蛋白的大小分布。接下来我们研究了PEG修饰蛋白多聚体及PEG Diol引起的交联多聚体对修饰后尿酸酶蛋白体内药代动力学和免疫原性的影响。大鼠在多次注射PEG修饰多聚体后出现了已经在PEG修饰脂质体中被确认的血液清除加快(ABC)现象。介导这种清除加快现象的不是中和抗体而是针对mPEG的IgM抗体,而且我们认为PEG修饰物的大小是诱发此类现象的首要因素。除去尿酸酶多聚体和PEG修饰剂中的PEG Diol杂质后,可成功避免此类现象的出现。 第三部分:5 kDa mPEG修饰人犬嵌合尿酸酶的临床前药理和安全性评价 首先构建了三个不同的动物模型分别用来评价5 kDa mPEG修饰人犬嵌合尿酸酶的降低血液尿酸作用、对尿酸性肾病的预防作用和对痛风性关节炎的治疗作用。在大鼠和食蟹猴体内静脉注射rnPEG-UHC后消除半衰期分别为34.9小时和134.3小时。两种动物体内皮下注射的生物利用度都高于60%,这表明皮下注射可以作为临床治疗时一个候选的注射途径。大鼠28天毒性研究表明,在临床观察、血液学和血液生化方面均未发现与药物相关的毒性作用。唯一的与给药相关的器官组织形态学改变是在1只中剂量大鼠(12.5%)和两只高剂量大鼠(25%)中发现了脾脏巨噬细胞空泡样变化,这种改变可能是由于针对]mPEG的IgM抗体介导并引发了脾脏单核巨噬细胞对mPEG-UHC蛋白的吞噬作用,但是这种改变并未带来任何病理性改变和功能性损伤。 本研究不仅提供了一个非常有价值的痛风治疗候选药物,而且对整个尿酸酶家族的结构和催化机理研究、由PEG修饰蛋白和纳米颗粒引起的血液清除加快现象研究、PEG修饰大分子蛋白的体内代谢和安全性研究等方面均有很好的参考价值。


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